复发性自然流产患者血清RLX-2，TIMP-1，TIMP-2的表达及其临床诊断价值

郭俊成,车秀英,王 健,赵富玺*

（1．山西大同大学免疫学研究所，山西大同037009；2．大同市第五人民医院急诊科，山西大同037004）

复发性自然流产 (Recurrent Spontaneous Abortion,RSA)系指连续自然流产≥3次,在育龄妇女中的发病率为0.4%～0.8%。RSA病因复杂,其中免疫学因素占65%以上[1]。松弛素-2(relaxin-2,RLX-2)为妊娠黄体产生的经典内分泌激素,在胚胎植入过程中,RLX-2可通过增加成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的合成、活化,在内膜蜕膜样变、血管形成以及组织重建等方面起着重要作用[2]。MMPs组织型抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)可特异性地抑制MMPs的活性,使细胞外基质处于动态平衡中,从而维持母胎界面的相对稳定[3]。

近年来报道,RSA患者绒毛和蜕膜组织中MMPs和 TIMPs均异常表达[4－5],而 RLX-2，TIMPs作为MMPs的调节分子,它们在血清中的表达水平如何,目前尚未见报道。本课题拟采用ELISA法对RSA患者血清中RLX-2，TIMP-1，TIMP2的表达水平进行检测,探讨RLX-2，TIMPs在RSA发生过程中的作用机制,评价RLX-2，TIMPs及RLX-2/TIMP-2对RSA的临床诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取200803－201005来山西省大同市第五人民医院妇产科就诊的有流产既往史(≥3次)的18例患者,在排除外生殖系统解剖畸形、生殖道感染，外伤刺激以及孕期内使用甾体类激素、催产或保胎性药物等混杂因素存在后,作为自然流产组(即实验组)。选取同一时期与之年龄匹配的无流产既往史的正常妊娠者,同样排除以上混杂因素后,作为对照组 (18例)。患者平均年龄32.5±2.6岁 (20～43岁)。

1.2 标本采集

在受试者妊娠6～8周、10～12周、20周以及34周时,分别抽取其前臂静脉血 20 mL,自然凝结后,离心3 000 r/min 10 min,置于-80℃备用。

1.3 RLX-2，TIMP-1，TIMP-2 ELISA法检测

TIMP-1,2 ELISA试剂盒购自上海研生生化试剂有限公司;RLX-2 ELISA试剂盒购自上海超研生物科技有限公司。实验仪器采用美国Bio-radimark全自动酶标仪。实验过程严格按照试剂盒说明书进行，主要包括:加样 (包括空白对照、标准对照、待测样品)37℃ 120 min;滴加检测溶液A液 100 μL,37℃ 60 min;滴加检测溶液B液 100 μL,37℃ 60 min;滴加底物溶液90 μL,37℃ 避光显色30 min;滴加终止液50 μL终止反应;测量OD值。

1.4 统计学分析

采用 SPSS10．0统计学软件进行数据分析。计量资料采用t检验或秩和检验 (根据方差齐性分析结果选择);RLX－2/TIMP－2的比值采用受试者工作特性曲线(ROC)分析。P＜0．05为差异具有显著性。

2 结果

无论是实验组还是对照组,血清RLX－2的水平在妊娠早期均呈上升趋势,10～12周达到高峰,随后下降,34周时又有所回升,但各个妊娠分期实验组明显低于正常对照组(表1),其差异具有显著性(P＜0．05);实验组血清TIMP－2的表达水平在各个妊娠分期均高于正常对照组(P＜0．05);TIMP－1在整个妊娠期与对照组的差异均无显著性(P＞0．05)。

表1 不同妊娠期患者血清RLX-2，TIMP-1，TIMP-2的表达水平以及RLX-2/TIMP-2比值

受试者工作特性曲线(ROC)分析结果显示,各个妊娠分期 RLX－2/TIMP－2比值的曲线下面积(AUC)均较 RLX－2,TIMP－2 高(表 2),其 AUC 在妊娠 10 ～ 12 周为最高(AUC=0．94,P＜0．000 1),最佳拐点为 RLX－2/TIMP－2 比值≤0．1(敏感度 100%,特异度 75%,阳性似然比 4．0,阴性似然比 0．00,P＜0．000 1)。

表2 各孕期RLX-2/TIMP-2比值的受试者工作特性曲线(ROC)分析结果

3 讨论

正常妊娠有赖于机体正常的内分泌激素水平以及母体与胚胎之间精密的协调作用,因此RSA患者血清中某些激素水平与免疫分子的表达常呈异常状态。RLX－2是与妊娠密切相关的生殖激素,主要由黄体产生,也可由子宫肌层、内膜、蜕膜及胎盘组织产生,其分泌与调节可对妊娠的许多环节产生影响[6]。MMPs是一组细胞外基质的蛋白水解酶,可选择性地水解子宫内膜基质及基底膜成分,从而有利于胚泡的植入和滋养层的形成。RLX－2可通过增加成纤维细胞MMPs的合成与活化,促进组织间质胶原和其它蛋白的分解,从而在胚胎与内膜的识别、内膜蜕膜样变及血管形成等方面起重要作用。有学者将人重组RLX用于灵长动物的体外受精过程,使其胚胎种植率显著提高[7],提示 RLX对改善胚胎种植微环境有正面作用。本实验结果显示,实验组血清RLX－2的水平在妊娠早期呈上升趋势,但12周后开始下降,且在整个妊娠期均明显低于正常对照组 (P＜0．05),提示RSA的发生可能与妊娠期RLX－2分泌水平不足有关。RLX－2分泌水平不足,可能阻碍胚胎与内膜的识别、内膜蜕膜样变以及局部血管的形成等,从而不利于胚泡的植入与胚胎的发展。而应用RLX－2则有可能改善胚胎种植微环境,提高胚胎种植率,增加治疗RSA的可能性。

TIMPs是MMPs活性的特异性抑制剂,可通过共价键与 MMPs相结合成1∶1复合体,特异性抑制MMPs的活性。MMPs和TIMPs的动态平衡对维持母胎之间的相对稳定状态至关重要,MMPs活性增强或TIMPs活性降低都会破坏母胎界面的动态平衡[8]。目前报道的TIMPs有至少4种:TIMP－1,TIMP－2,TIMP－3,TIMP－4,其中 TIMP－1 和 TIMP－2在细胞外基质合成及降解代谢平衡中起关键作用。在本研究中,流产组血清中TIMP2的表达水平在整个孕期均高于正常对照组 (P＜0．05),由此推断,RSA的发生可能与患者全身 TIMP2水平过高有关。尽管流产患者胎盘组织中MMPs高度表达,但血循环中过高水平的 TIMP－2对母胎界面 MMPs的活性起到抑制作用,从而不利于胚泡的植入和滋养层的形成。整个妊娠期TIMP－1在实验组与对照组之间的差异无显著性 (P＞0．05),说明血清 TIMP1水平与RSA的发生关系不大。

值得注意的是,受试者工作特性曲线 (ROC)分析结果显示,各个妊娠分期RLX－2/TIMP－2比值的曲线下面积(AUC)均较 RLX－2，TIMP－2 高(表 2),在妊娠 10 ～ 12 周达到最高(AUC=0．94,P＜0．000 1),提示妊娠10～12周时,RLX－2/TIMP比值较单独的血清RLX－2,TIMP－2水平对复发性流产的临床诊断价值更大;妊娠 10～12周,RLX－2/TIMP－2比值最佳拐点为≤0．1(敏感度100%,特异度75%,阳性预测值 4．0,阴性预测值 0．00,P＜0．000 1)。这提示 RLX－2/TIMP－2比值可能作为一项新的诊断指标而应用于RSA的临床诊断,且妊娠 10～12周时 RLX－2/TIM－2P比值≤0．1对RSA的临床诊断价值最大。

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