依托泊苷聚乳酸微球的制备

姜素芳，张云坤，周学军

（湖南师范大学医学院，湖南 长沙410013）

依托泊苷是目前常用的抗肿瘤药物之一，具有广谱抗癌活性和相当高的治疗指数，尤其对早期扩散的小细胞肺癌效果良好[1,2]，其主要毒性为骨髓抑制、消化道毒性及嗜中性白细胞的严重减少[3]，本实验旨在以生物降解性高分子材料聚乳酸为载体,制备依托泊苷聚乳酸微球，通过控制其粒径大小，使其静脉注射后能浓集于肺组织，缓慢释放依托泊苷，从而降低全身药物浓度，减少全身毒副作用。

1 仪器与试剂

FJ-200高速分散均质机 (上海标本模型厂)；78Hw-1型恒温磁力搅拌器 (江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；TG16G台式高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；生物显微镜(重庆光电仪器有限公司)；依托泊苷(中南大学药学院提供)；聚乳酸 [PLA分子量30000](山东医疗器械研究所)；明胶(上海化学试剂公司)。

2 方法与结果

2.1 依托泊苷的测定

2.1.1 标准曲线的绘制

精密称取依托泊苷50 mg，置50 mL容量瓶，用氯仿溶解、定容，作为储备液。分别取储备液1,2,3,4,5 mL于50 mL容量瓶中，加氯仿定容，用紫外分光光度法在285 nm波长下测各标准液的吸光度值A，将相应数据进行线性回归，得回归方程。A=6.854C-0.008979(mg/mL)，r=0.9999，说明依托泊苷溶液在20～100 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.2 回收率实验

精密称取依托泊苷及空白微球适量于50 mL量瓶中氯仿溶解并定容，分别吸取1,2,5mL于50 mL容量瓶中，氯仿定容，在285 nm波长测吸光度，按标准曲线方程计算回收率。结果高、中、低浓度平均回收率分别为99.6%，98.1%，98.4%。

2.2 微球载药量和包封率的测定

精密称取依托泊苷聚乳酸微球30 mg于50 mL量瓶中，加入氯仿超声溶解并定容，过滤并测定吸光度，代入标准曲线方程计算药物浓度，按下式计算微球载药量和包封率。

2.3 依托泊苷聚乳酸微球的制备

采用乳化-溶剂扩散法制备。将依托泊苷和聚乳酸溶于有机溶媒中，搅拌使其溶解作为油相；在一定的搅拌速度下用注射器将油相缓慢注入分散介质中，搅拌乳化一定时间，再把其倾入到大量的蒸馏水中，搅拌一定时间，离心收集微球，常压干燥即得。

经单因素考察，确定有机溶媒为二氯甲烷、分散介质为明胶水溶液、O/W比例为5/40，搅拌速度为1200 r/min时，微球形态好，成球率高，粒径大小适宜且不粘连。固定以上条件，选择对微球包封率和载药量影响较显著的三个因素即明胶浓度、PLA浓度以及投药比VP/PLA进行正交实验设计，每个因素确定三个水平，采用L9(34)正交表进行正交试验，优化制备处方和工艺。因素水平见表1、结果见表2。

表1 正交因素水平表

表2 L9(34)正交试验设计与结果

由极差分析可知，最佳实验方案为A1B2C3，即分散介质明胶的浓度为1%(w/v)，投药比(依托泊苷：聚乳酸)为1:3(w/w)，有机相中聚乳酸浓度为5%(w/ v)。在此优化条件下制备3批依托泊苷微球，测得药物包封率和载药量见表3。

表3 三批样品的载药量和包封率

2.4 依托泊苷聚乳酸微球的形态和粒径

将依托泊苷聚乳酸微球均匀分散于载玻片上，使用带测微尺的光学显微镜记录500个微球的粒径，粒径分布情况见图1，平均粒径为12.87μm。微球外观圆整，大小均匀，无粘连。见图2。

图1 微球粒径分布图

图2 光学显微镜下微球照片

2.5 依托泊苷聚乳酸微球的体外释药特性

采用动态渗析法[4]：精密称取依托泊苷聚乳酸微球250 mg置于透析袋内，加pH 7.4磷酸缓冲液5 mL封口，装入水浴恒温振荡仪中，以250 mL pH 7.4磷酸缓冲液作释放介质，(37±0.1)℃恒温释放，定时吸取介质3 mL，加氯仿6 mL混合，离心，在285 nm处测吸光度，并按标准曲线方程计算累积释放百分率(Q)。释药曲线见图3。

经拟合，释药曲线符合Higuchi方程：Q=4.721 t1/2+15.00，r=0.9903,10d累积释药量约85%，T1/2为55.0h，说明所得依托泊苷聚乳酸微球具有明显的缓释作用，最初5 h微球释药达21%，说明有一定的突释，之后逐渐变为缓释过程，释药符合长效制剂的特征。

3 讨论

依托泊苷是一种脂溶性药物,在水中几乎不溶,因此非常适于用O/W乳化法制备载药微球,其中乳化剂的选择对微球的形成影响较大[5]。实验中曾尝试采用PVA作乳化剂，结果制得的乳剂不稳定，易聚集，所得微球粘结，后改用明胶作为乳化剂，获得稳定、圆整均匀的微球。原因可能是PVA亲水性较强，水溶液粘度不够大，不能形成稳定的o/w型乳滴，而明胶水溶液粘度较高,乳化能力更强，可在体系中形成牢固的界面膜获得稳定乳剂从而避免微球粘结。

作为肺靶向药物，关键是控制微球的粒径，据文献报导粒径在10～20μm的微球静脉注射后可被肺部机械截留从而提高肺部药物的浓度[6]。本试验通过调节O/W比例、乳化时搅拌速度、聚乳酸的浓度、乳化时油相加入的方式和速度等因素，获得粒径符合要求、光滑圆整不粘结的微球，进而再采用正交实验设计，确定最佳处方工艺，进一步提高了微球的包封率和载药率。制得的依托泊苷微球体外释药曲线符合Higuichi方程，具有明显的缓释特征，但关于其体内的释药和靶向性能还有待于进一步研究。

[1]Stahelin HF,von Warturg A.The chemical and biological route from podophyllotoxin glucoside to etoposide[J].Cancer Res,1991,51(1):5-15.

[2]Joseph Aisner MD,Edward J.Lee MD.Etoposide:Current and future status[J].Cancer,1991,67(Suppl 1):215-219.

[3]刘瑞林,李滨,杨铭,等.高效液相色谱法检测人血浆中的依托泊甙[J].药物分析杂志,1994,14(5):40.

[4]张志清,杨秀岭,孙莉,等.依托泊苷白蛋白微球的制备[J].中国药学杂志,2000,35(3):171.

[5]王哲,倪宏哲,张明耀,等.聚乳酸微球制备工艺的研究[J].高分子材料科学与工程,2007,23(6):207-210.

[6]Huo D,Deng S,Li L,et al.Studies on the poly(lactic-coglycolic)acid microspheres of cisplatin for lung-targeting [J].Int J Pharm,2005,289(1-2):63-67.