PCNA与AgNOR在肝细胞肝癌中的表达及其关系的研究

马丽丽 岳 麓 邱文生▲

（1.青岛大学医学院，山东青岛 266000；2.青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东青岛 266000）

增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一种核蛋白，参与DNA的合成和修复，仅在增殖细胞中表达，较高的PCNA增殖指数（PCNA PI）预示着较高的肿瘤细胞增殖活性。一般认为PCNA PI越高，肿瘤的增殖能力越活跃，其分化程度越低，恶性程度越高，越容易发生浸润和转移[1-3]。AgNOR（silver-binding nucleolar organizer regions）是核仁组成区相关嗜银蛋白，AgNOR颗粒数与细胞增殖活性、DNA倍体水平有关[4]。两者均是反映细胞增殖活性的主要客观指标。为探讨两者的相互关系及其与生物学行为及预后判断的关系，笔者利用PCNA免疫组化研究和AgNOR检测，对比不同分化程度的肝细胞肝癌（HCC）细胞的特点。

1 材料与方法

1.1 研究材料

青岛大学医学院附属医院病理科2000～2007年经病理确诊为肝细胞肝癌患者的手术切除标本67例。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片4μm，HE染色。组织分类按WHO分类标准分级，高分化19例，中分化36例，低分化12例。按肿块长径分为＜3cm组7例、3～5cm组20例、＞5cm组40例。术前未经放化疗治疗，术后随访2年以上，其中术后生存（2年以上）15例，术后短期死亡（半年以内）11例，生存期在半年～2年41例。所有病例标本进行PCNA免疫组化检测和AgNOR检测。

1.2 研究方法

PCNA免疫组化检测采用LSAB法，PCNA（Pcl0）及LSAB试剂盒为美国Dako公司产品；免疫组化检测标准：阳性为细胞核呈界限清楚的棕褐色反应。阳性结果记录标准：每张切片随机观察高倍视野5个，每个视野计肿瘤细胞100个，计算增殖指数（PI＝PCNA阳性细胞核数/计测细胞总数）。PCNA PI可分为3级：Ⅰ级（0～25%），Ⅱ级（26%～75%），Ⅲ级（76%～100%）。AgNOR银染方法：按Ploton改进的石蜡切片AgNOR染色方法；银染阳性判断标准：清晰的大小不等的棕黑色银染AgNOR颗粒位于细胞核内。图像分析技术（IAT）测量AgNOR颗粒数：切片经多功能图像分析仪（放大倍数10×40），对每例切片肿瘤细胞核内阳性颗粒进行计数，每例随机检测50个肿瘤细胞，取其平均值为最后结果。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 PCNA PI及AgNOR颗粒数与组织学分级的关系

随着组织分化程度的降低，PCNA PI逐渐增大，AgNOR颗粒数逐渐增多。统计学分析显示：低分化肝癌、中分化肝癌和高分化肝癌之间差异显著（P＜0.01）。见表1。

表1 PCNA PI及AgNOR颗粒数与组织学分级的关系（±s）

表1 PCNA PI及AgNOR颗粒数与组织学分级的关系（±s）

组织学分级 n PCNA PI（%） AgNOR颗粒数（个）高分化 19 10.700±7.123 3.29±1.17中分化 36 36.500±7.874 3.93±0.90低分化 12 61.600±16.382 7.07±1.84

2.2 PCNA PI及AgNOR颗粒数与肿块大小的关系

肿瘤最大径＜3cm组、3～5cm组、＞5cm组的PCNA PI分别为22.6%、30.9%、37.7%，AgNOR计数分别为（2.89±0.41）、（3.70±1.19）、（4.79±2.03）。统计学分析显示：肿瘤最大径＜3cm组与肿瘤最大径＞5cm组之间有显著差异（P＜0.01）；肿瘤最大径＜3cm组与肿瘤最大径3～5cm组、肿瘤最大径3～5cm组与肿瘤最大径＞5cm组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。由此可见，PCNA PI及AgNOR颗粒数与肿块大小有关，即肿瘤肿块越大、其PCNA PI越大，肿瘤肿块越大、AgNOR颗粒数越多。

2.3 PCNA PI及AgNOR颗粒数与预后的关系

对67例患者全部进行了术后随访，两者与预后的关系见表2。生存期＞2年患者的PCNA PI明显小于生存期≤2年的患者，尤以与半年内死亡的患者有明显差异。统计学分析显示半年内死亡的患者与生存期＞2年的患者PCNA PI之间有显著差异（P＜0.01）；生存期半年～2年的患者与生存期＞2年的患者PCNA PI之间差异有统计学意义（P＜0.05）。AgNOR颗粒数与肝癌术后生存期有关，肝癌患者的AgNOR颗粒数随着患者的生存期增高而减少，即生存期越短、AgNOR颗粒数越多，生存期越长、AgNOR颗粒数越少。统计学分析显示：生存期＞2年与半年内死亡、生存期半年～2年与半年内死亡患者的AgNOR颗粒数之间有显著差异（P＜0.01）；生存期＞2年与生存期半年～2年差异无统计学意义（P＞0.05）。提示PCNA PI与肝细胞肝癌患者的预后有关，AgNOR颗粒数与肝细胞肝癌患者的预后有关。

表2 PCNA PI及AgNOR颗粒数与肝癌预后的关系（±s）

表2 PCNA PI及AgNOR颗粒数与肝癌预后的关系（±s）

预后 n PCNA PI（%） AgNOR颗粒数（个）生存期＞2年 15 18.05±5.51 3.35±1.05生存期半年～2年 41 27.52±6.20 4.14±1.65半年内死亡 11 36.65±7.25 6.01±2.30

2.4 PCNA PI与AgNOR颗粒数的关系

由表3可见，生存期＞2年组中，随PCNA分级的增高，AgNOR颗粒数有递增的趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）；由表4可见，半年内死亡组中，PCNAⅡ级的AgNOR颗粒数有高于Ⅰ级的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），PCNAⅠ级、PCNAⅡ级与PCNAⅢ级的AgNOR颗粒数之间差异有显著性（P＜0.01）。67例患者中，随PCNA分级的增高，AgNOR颗粒数增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 生存期＞2年的肝癌患者PCNA分级与AgNOR颗粒数的关系

表4 半年内死亡的肝癌患者PCNA分级与AgNOR颗粒数关系

3 讨论

PCNA是存在于细胞核中的一种非组蛋白，为DNA聚合酶的辅助蛋白，参与调节DNA合成，并影响细胞的增殖活动，也是一种细胞周期调节蛋白，其表达的程度和含量反映了细胞增殖的活性，在G1早期开始上升，S期达到高峰，G2、M期持续下降，G0期维持在极低水平[5]。在G1/S转换期，PCNA发生磷酸化，再与DNA合成部位结合，激活DNA复制因子，促使增殖。因PCNA存在于增殖细胞核内而静止期细胞缺乏，故PCNA免疫组化染色可作为估计细胞增殖活性的指标，并且其增殖指数分级与肿瘤分级、预后有一定关系[6]。本研究显示，PCNA表达与肝癌组织学分级、肿块大小及生存期有关。PCNA PI在高分化肝癌（10.70±7.12）、中分化肝癌（36.50±7.87）及低分化肝癌（61.60±16.38）中依次呈升高趋势；肿瘤肿块越大，其PCNA增殖指数越高；PCNA增殖指数越高，生存期越短。说明PCNA高表达者增殖力较强，肿块较大，组织学分级较高，分化程度较低，同时生存期缩短，预后较差。提示PCNA表达与肝细胞肝癌生物学行为有一定的关系，可作为预后指标。

AgNOR是与rRNA相关的酸性非组蛋白，其功能是保持rRNA链伸展，调节rRNA转录，从而影响核糖体的形成和细胞内蛋白质的合成。所以AgNOR颗粒数变化可以作为rDNA转录活性的指标。由于其数量的多少可直接反映出细胞增殖活性的程度，所以将其作为细胞增殖，动力学的重要参数用于肿瘤研究[7]。本研究结果表明AgNOR颗粒数与肝细胞肝癌组织学分级和预后关系上表现出AgNOR颗粒数的增多与肝细胞肝癌分化降低和生存期缩短有关，还表现出肿块越大，AgNOR颗粒数增多。这说明可以从AgNOR颗粒数变化的定量角度来判断肝细胞肝癌的生物学特征和预后。

本研究结果尚显示PCNA PI与AgNOR颗粒数在肝细胞肝癌的表达中呈正相关性，即随着PCNA分级的增高，AgNOR颗粒数也增多（P＜0.01），提示结合PCNA PI和AgNOR颗粒数检测能更加准确反映肝癌细胞的增殖程度，判断肝细胞肝癌的生物学行为和患者的预后。

PCNA是DNA合成中的重要调控因子，能够客观地反映细胞周期变化，而AgNOR则在rRNA的合成中发挥重要作用，可以反映蛋白质的合成，二者均能较好地反映出肿瘤细胞的增殖活性。在原发性肝细胞肝癌组织中，由于肿瘤细胞异常增殖，可表现为分化程度越低，PCNA PI增高；分化程度越低，AgNOR颗粒数增多。PCNA PI与肿瘤肿块的大小及预后有关，AgNOR颗粒数也与肿瘤肿块的大小及预后有关；同时在研究中还发现，PCNA PI与AgNOR颗粒数呈正相关性，在PCNA PI增高的同时，AgNOR颗粒数也增多。本研究显示同时检测PCNA PI和AgNOR颗粒数，可更加全面地了解肿瘤细胞的生物学行为、增殖程度和患者的预后。因此联合检测PCNA PI与AgNOR颗粒数，可作为评价原发性肝细胞肝癌的增殖与组织分级状态的指标，对判断疾病的预后有重要的临床价值。

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