基因横向转移在细菌进化中的作用

王磊 刘斌（南开大学天津300071）

基因横向转移在细菌进化中的作用

王磊 刘斌（南开大学天津300071）

生物进化研究处于生物科学体系的核心和前沿。自达尔文创立进化论以来，随机突变一直被认为是进化的动力，基因横向转移在进化中的作用和发生机制是近年来生物进化研究中的难点。在项目研究过程中创新研究方法，探索极端环境细菌重要功能和细菌表面多糖抗原的进化规律，研究基因横向转移的作用和发生机制。项目完成对认识生物进化具有重要科学意义，对微生物遗传育种、新发病原体防控等具有重要应用价值。

基因横向转移细菌进化

生物进化研究处于生物科学体系的核心和前沿。自达尔文创立进化论以来，随机突变一直被认为是进化的动力，基因横向转移在进化中的作用和发生机制是近年来生物进化研究中的难点，“基因横向转移为什么及如何在众多物种间发生？（Why does lateral transfer occur in somany speciesand how？）”被Science列为需要解决的125个重要科学问题之一。由于研究难度较大，研究人员较少，关于基因横向转移的作用和机制的论文也较少。

无法有效发现受体中的横向转移片段、无法溯源供体研究发生机制、横向转移基因功能未知而无法研究其作用成为该问题的主要研究难点。代表着生命对环境极限适应能力的极端环境细菌和具有自然界中最丰富生物多样性之一的细菌表面多糖抗原，是研究这一问题的良好材料，只是相关研究尚处起步阶段。我们自2002年开始，创新研究方法，探索极端环境细菌重要功能和细菌表面多糖抗原的进化规律，研究基因横向转移的作用和发生机制。通过基因组和比较基因组学方法，发现和鉴定了大量受体中的横向转移片段；通过比较基因组学和多糖结构分析相结合的方法，在具有相似多糖结构的细菌中溯源获得了部分横向转移片段的供体信息，并研究了横向转移发生机制；通过功能基因组学和生物化学方法研究相关基因功能，在遗传事件和功能改变之间建立联系，并研究了横向转移的作用。本项目对认识生物进化具有重要科学意义，对微生物遗传育种、新发病原体防控等具有重要应用价值。

2002年至2008年2月，本项目共在SCI刊物发表论文40篇（影响因子大于3.0的18篇），他人正面引用296次。8篇代表性论文（王磊教授均为通讯作者）他人正面引用154次，其中28次被Nature Reviews Microbiology等国际权威刊物的综述性文章正面评论。获31项发明专利授权。获2007年天津市自然科学一等奖和2009年第二届谈家桢生命科学创新奖。

1 项目的主要研究成果

1.1 首次揭示了细菌长链烷烃降解途径和关键酶的功能，发现了一株重要石油降解细菌，适应油藏环境最关键的烷烃降解能力的进化形成是由基因横向转移介导的

石油微生物在高温、低氧的油井中生存，以烷烃等石油成分为唯一营养源。石油微生物，尤其是降解长链烷烃的菌株，在石油开采和污染治理领域具有重要应用价值。目前对石油微生物的研究主要集中在菌种的分离，而对其降油的分子机制及进化途经的研究基本是空白。我们从大港油田分离到一株具有专一降解长链烷烃能力的革兰氏阳性嗜热细菌——NG80-2。综合运用基因组学和功能基因组学方法，分析了该菌株降解长链烷烃、适应油藏环境的分子机制以及进化途经。

基因组学研究发现NG80-2携带的土壤菌是典型的代谢纤维二糖、木聚糖等植物多糖来源的基因，并且这些基因没有在最近发生基因横向转移的痕迹；同时NG80-2具有土壤菌典型的代谢途径，包括20种必需氨基酸的合成途径等，表明NG80-2起源于土壤菌。

结合基因组学、蛋白质组学、荧光定量PCR、体内功能互补及体外酶学方法，首次在国际上鉴定了长链烷烃降解途经及编码基因。解析了该途径中的关键蛋白——长链烷烃羟化酶（LadA）的结构和作用机理。LadA为目前已知的降解烷烃碳链最长（C15－C36）的羟化酶，与已报道的中短链烷烃羟化酶相比具有更广泛的应用价值。功能研究发现LadA对长链烷烃分子的捕获和结合是整条降解途径中的关键步骤，直接决定着细菌可降解烷烃碳链的长度。

发现ladA在过去不太长的进化时间内通过基因横向转移进入NG80-2，结合该菌中其他烷烃降解相关基因，从而形成了该菌降解长链烷烃的能力。因此，ladA通过基因横向转移进入NG80-2是其从土壤菌进化为石油降解菌的关键步骤。

成果于2007年在PNAS上发表，并入选当年“中国高等学校十大科技进展”。同年10月Nature系列期刊的Nature Reviews Microbiology在其《新闻与分析》News&Analysis栏目用半页的篇幅整体性评论介绍了该成果：“基因组学分析发现了对于NG80-2菌株适应油藏环境具有重要作用的一系列基因；发现获得一个来自质粒的烷烃单加氧酶基因ladA（编码的蛋白催化烷烃降解途径的第一步反应）是NG80-2形成长链烷烃降解能力的关键；NG80-2灵活的呼吸系统有益于其生存；NG80-2基因组上具有的许多编码序列（包括一系列多糖的降解基因和一个植物来源木聚糖的代谢基因簇等）表明其起源于土壤菌”，“微生物用于环境污染物的生物修复是研究热点”，“NG80-2菌株分离自中国油田地下深层油藏环境，可以在有氧环境下利用C15-C36的长链烷烃作为唯一碳源；烷烃作为石油的主要成分，是石油污染生物修复的主要靶标”，“LadA蛋白由于具有氧化难以降解的长链烷烃的能力，因此在生物修复方面具有重要应用价值”等。

美国发行量排名第3的The New York Times 2007年3月20日在其科学新闻中的《观察站》栏目以“喜欢吃石油的细菌”为题报道了该成果。指出“中国南开大学的科学家获得了一株可以‘吃石油’的细菌的全基因组，并发现了负责降解长链烷烃的关键酶LadA，LadA可用于石油泄漏的清理”。

1.2 比较基因组学分析了一株可在极端酸性条件下降解甲烷（第二主要温室气体）的细菌，发现了基因横向转移推动了变形菌门之外该株新型甲烷氧化菌的进化形成

甲烷是第二主要温室气体，极酸性地热环境是大气中甲烷的主要来源之一，微生物降解是甲烷分解的主要途径。以前普遍认为只有变形菌门（Proteobacteria）中的一些菌株具有甲烷代谢相关基因，但这些菌株只能在中性或中度酸性的环境生长。变形菌门之外是否存在甲烷氧化菌，如存在它们是如何获得甲烷氧化能力成为目前的研究热点。

该工作分离到可在pH值为1.5的极端酸性环境下降解甲烷的菌株V4，通过基因组测序、比较基因组学和进化分析，确定该菌为疣微菌门（Verrucomicrobia）细菌。该成果获得了疣微菌门中第一个完整基因组序列，比较基因组学工作发现V4全部编码蛋白中的23%（包括甲烷单加氧酶等参与甲烷降解途径的酶）与进化关系较远的变形菌门细菌的编码蛋白相似性最高，表明V4与变形菌门中的甲烷氧化菌等远缘菌之间在很久的进化时间之前发生了大量基因横向转移事件，这些事件是V4获得甲烷降解能力和完整细胞功能的动力。

发现V4具有3个不同的编码甲烷单加氧酶（负责甲烷降解途径中的关键的第一步）的操纵子，其相似性为50%～90%，但它们与变形菌门中的甲烷单加氧酶基因进化距离较远，并形成了一个独立的进化分支，说明将甲烷代谢相关基因引入V4的横向转移事件发生在很久的进化时间之前，且其后在疣微菌门和变形菌门之间没有发生相关横向转移。

我们的研究成果于2007年在Nature发表。Annual Review of Microbiology 2009年在题目为“The Expanding World of Methylotrophic Metabolism”的综述中全面介绍了甲基营养菌的代谢机制和生态方面的最新研究进展，其中对该成果的评论为：“发现疣微菌门中的一些菌株具有氧化甲烷的能力，是最壮观（mostspectacular）的新发现之一，使我们对甲基营养菌分布的认识在现有基础上有了新的扩展”，因为“虽然这些甲烷氧化菌与已知的变形菌门中的甲烷氧化菌亲缘关系较远，但它们仍使用典型的颗粒型甲烷单加氧酶（进化关系较远）来代谢甲烷”，“虽然疣微菌门中的细菌在不同环境中大量存在，但它们大部分不可培养，因此对于它们在特定生物地球化学过程中的作用缺乏研究”。Annual Review系列每年分别对40余个学科各发表1卷年评，评述该学科中最重要的研究进展，综述均由各领域顶尖科学家撰写，其中Annual Review of Microbiology每年对当时微生物学领域若干个最重要的进展进行一次系统性的总结。

英国应用微生物学会期刊Environmental Microbiology Reports 2009年发表社论（Editorial），由甲烷氧化菌领域权威、英国沃里克大学的JC.Murrell教授撰写，题目为“The microbial methane cycle”。该社论全面介绍参与甲烷循环的微生物的多样性、性状和代谢机制，指出该项目成果“获得的甲烷氧化菌V4的基因组信息，对于疣微菌门甲烷氧化菌生理、生化特性的研究，具有难以估量的价值”。

1.3 发现基因横向转移是自然界中最丰富的生物多样性之细菌表面多糖抗原多样性在宿主选择压力下进化形成的主要途径，并发现同源重组、质粒转移等是横向转移发生的主要机制

该方面工作以人类专属致病性志贺氏菌的所有表面多糖抗原为核心，同时选择同为人类肠道菌的大肠杆菌、沙门氏菌（基因横向转移可能性较高）的表面多糖抗原，以及与志贺氏菌、大肠杆菌亲缘关系较远的种属（霍乱弧菌、军团菌、阪崎肠杆菌、变形杆菌等，基因横向转移可能性较低）中具有相似结构或相同罕见单糖的表面多糖抗原，共计300余种，进行基因簇、基因功能和进化的分析，寻找基因横向转移是否是致病菌进化动力的证据。并利用其多样性的特点，通过比较基因组学和多糖结构分析相结合的方法，在具有相似多糖结构的细菌中寻找可能的横向转移片段供体，以研究横向转移发生机制。

发现基因横向转移是人类专属致病性志贺氏菌表面多糖抗原多样性和该菌致病性在短时间内快速形成的主要机制，志贺氏菌仍在快速进化中。

我们破译了27种志贺氏菌表面多糖抗原基因簇，结合以前的数据，系统地完成了对志贺氏菌全部34种表面多糖抗原遗传信息的整体比较分析。志贺氏菌是在较近的进化时间由3个主要的起源从大肠杆菌进化而来的。我们发现志贺氏菌与大肠杆菌具有21组相同或高度相关（同源性99%～100%）的表面多糖抗原基因簇，表明在志贺氏菌从大肠杆菌分化出来之后，二者多糖抗原基因簇间频繁的横向转移（主要由同源重组介导）是志贺氏菌表面多糖抗原多样性快速形成的主要机制。发现这些基因簇在通过横向转移进入志贺氏菌后，在短时间内发生了较多遗传事件（基因横向转移和突变等），表明志贺氏菌在人体环境的选择压力下发生了很多改变。且这类遗传事件在志贺氏菌多糖抗原基因簇中出现的比率（50%）明显高于在大肠杆菌多糖抗原基因簇中出现的比率（33%），表明志贺氏菌仍在“快速”进化过程之中。

我们系统地研究并实验重现了由基因横向转移介导的一个细菌表面多糖抗原的进化形成，发现了该过程中的横向转移供体、横向转移方式和横向转移的作用。痢疾志贺氏菌1型可引起严重的细菌性痢疾,表面多糖抗原变化可导致该菌致病性减弱。发现痢疾志贺氏菌1型由横向转移获得的表面多糖抗原基因簇的供体为大肠杆菌0148，基因簇两端的galF和gnd基因的同源重组介导了横向转移的发生，之后其基因簇中一个糖基转移酶基因wbbG发生突变失活，同时该菌通过获得一个外源质粒（基因横向转移的初级形式）进而获得了一个该质粒上的糖基转移酶基因wbbP（与wbbG负责不同二糖键的合成），最终形成了有利于其致病性的多糖抗原。

发现远缘种属间的基因横向转移也可推动细菌表面多糖抗原多样性的形成。

寡糖分子跨膜运输是生物细胞的重要功能之一，真核与原核生物的寡糖转运系统具有一定共性。我们在大肠杆菌052中首次发现ABC转运系统负责大肠杆菌异多糖表面多糖抗原的转运。整体分析显示其他大肠杆菌异多糖表面多糖抗原均通过翻转酶完成转运，且基因簇中没有ABC转运系统编码基因，表明052表面多糖抗原基因簇很可能以基因横向转移的方式由其他种属进入大肠杆菌。

该方面成果发表25篇SCI论文。2008年国际微生物学权威综述期刊FEMSMicrobiology Reviews基于我们系统解析志贺氏菌表面多糖抗原多样性遗传进化机理方面的成果，邀请王磊教授撰写综述，责任编辑以色列特拉维夫大学的D.Gut nick教授在邀请函中指出我们研究的问题“是非常及时的”，同行评审专家指出：“这是一篇对志贺氏菌0抗原遗传和结构令人感兴趣和全面的综述，代表了对这一领域重要和全新的贡献”。国际主要科技图书出版社——Springer的Endotoxins:Structure,Function and Recognition主编在2009年邀请王磊教授撰写革兰氏阴性细菌表面多糖抗原多样性章节的邀请函中指出“你在这一领域的贡献已获得国际认可”。

1.4 成功建立基于细菌表面多糖抗原特异分子标识的致病菌分子生物学检测技术体系，在继承传统血清学检测技术优点的基础上，提高速度1～7倍

表面多糖抗原具有自然界最丰富的多样性之一，自20世纪30年代以来一直是血清学检测的靶标。血清学检测目前仍是最灵敏和特异的常规使用的检测方法。分子生物学检测技术具有速度快且易于大规模使用的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展方向，但当前的难点在于DNA靶标分子特异性较低，还不能取代传统的血清学检测。

表面多糖抗原多样性由合成基因簇的遗传多样性导致。我们通过对志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、军团菌等300余种表面多糖抗原基因簇的进化分析，发现其中两类基因（糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因）主要进化方式为突变，横向转移现象很少，具有高度抗原特异性。我们据此筛选出300余种细菌（包括志贺氏菌全部34种血清型等）的多糖抗原特异分子标识。

利用这些特异分子标识建立了针对123种（或血清型）致病菌的快速检测技术，包括：首次建立的针对志贺氏菌和沙门氏菌全部表面多糖抗原的分子检测技术，针对15种血清型的志贺氏菌和致病性大肠杆菌的快速检测技术，针对引起婴幼儿腹泻和败血病的大肠杆菌0114的快速检测方法等。该技术（3～12小时内完成检测）既继承了血清学检测技术灵敏度高和特异性好的优点，又弥补了其耗时长、工作量大的不足（传统方法需要24小时以上），具有重要应用价值。

可检测的123种（或血清型）致病菌包括：34个血清型的志贺氏菌、46个血清群的沙门氏菌、8个血清型的致病性大肠杆菌、23个血清型的肺炎链球菌，以及阪崎肠杆菌、霍乱弧菌01及0139、军团菌、单核李斯特菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、蜡样芽孢杆菌、链球菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌等。

该方面成果获31项发明专利授权，发表SCI论文9篇。我们建立的该检测技术已被国内外广泛借鉴和引用。芬兰国家公共卫生研究所利用我们的技术，对分离自农场居民和牛身上的样品中的大肠杆菌0174菌株进行了筛查。美国农业部在建立针对不同致病菌检测技术的2篇论文中均借鉴了我们的检测技术并引用了我们的论文。

2 项目应用

2009—2010年，我们利用这项技术帮助上海市疾病预防控制中心建立了较完善的致病菌分子生物学检测技术体系。其中针对123种细菌的分子生物学检测技术已应用于2010年上海世博会的公共卫生安全保障工作和突发事件处理并获好评。世博会期间在常规检测中，共完成2 160例食品、饮用水、粪便等样品的检测，检出阳性样品30例，经传统检测方法复核，准确率为100%，未发生因漏检而引起感染的情况。在世博会期间突发事件的处理中，我们的技术用于食物中毒、水污染、医院内感染等突发事件的应急检验，均快速、准确地检测出志贺氏菌、沙门氏菌、军团菌等致病菌。■

2011-03-08