脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能及细胞凋亡的影响

杨松林 王清勇 向光红 易艳辉 朱德茂

湖南省脑科医院神经内科 长沙 410007

细胞治疗或细胞替代治疗是近年来医学领域研究的热点和前沿,骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一群具有向多种细胞分化的多潜能组织干细胞,BMSCs脑内移植可以明显改善卒中大鼠的肢体功能。有研究表明间充质干细胞(UCBMSCs)的体外扩增能力、细胞原始性均高于骨髓,并具有很强的可塑性[1]。本文分离培养人UCBMSCs,早期移植给大脑中动脉闭塞(MACO)模型大鼠,观察其对大鼠神经功能及神经细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 选择清洁级健康雄性SD大鼠36只,随机分为假手术组(n=12)、对照组(n=12)和移植组(n=12)。试剂:特优级胎牛血清(杭州四季青公司),DMEM/F12培养基(GIBCO),人淋巴细胞分离液(1.077g/mL,天津TBD公司),CO2培养箱(美国Thermo 3111),SP试剂盒(北京中杉金桥公司),鼠抗人CD44,CD34单克隆抗体,鼠单抗BrdU抗体(武汉博士德公司),TUNEL试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2 UCB-MSCs的分离、培养 经产妇同意,采集我院产科健康分娩新生儿脐带血。新生儿娩出正常断脐带后,常规消毒脐带侧,用一次性采血袋收集脐带血,摇匀后冰盒保存,4 h内送实验室行细胞分离。脐血与PBS按1∶1混匀,叠加于人淋巴细胞分离液上,2000 rpm离心20 min。小心吸取界面单个核细胞层,加入5倍体积的PBS缓冲液,1200 rpm离心5 min,洗涤2次,弃上清。所得单个核细胞经台盼蓝染色,光学显微镜下计数活细胞数达85%以上方进行以下实验。调整细胞密度至1×106/mL接种于含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,置5%CO2、37℃培养箱中培养。每天半量换液,72 h后更换培养基,去掉未贴壁的细胞,根据细胞生长状况,每3 d换液一次。待细胞生长达80%融合, 0.25%胰蛋白酶消化,1∶2传代培养。

1.3 UCBMSCs表面标志的鉴定 制备细胞涂片,以PBS冲洗2遍,4%多聚甲醛4℃固定20 min,蒸馏水冲洗2次, PBS冲洗3×5 min,每孔加3%双氧水室温孵育20 min以消除内源性过氧化酶;PBS冲洗3×5 min,加入0.3%TritonX-100,室温孵育30 min加强抗体进入胞浆。PBS冲洗后以封闭血清封闭30 min,吸出血清分别加入1∶100抗CD44抗体、1∶200抗CD34抗体,4℃孵育过液,PBS洗去一抗,按SP试剂盒说明完成免疫细胞化学各步骤,DAB显色,常规脱水透明封片。显微镜下计数至少400个分散细胞,并计数CD44、CD34阳性细胞数。

1.4 大鼠MACO模型制作 对照组和移植组采用线栓法制作MACO模型,术前禁食12 h,不禁水,用100 g/L的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,在颈部中央切口,分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉,于颈总动脉分叉下方剪一切口,将一预先用乙醇灯烧成圆头的尼龙线(4～0号,圆头直径0.3 mm)置入颈内动脉18 mm左右,直到有轻微阻力感为止,阻闭120 min后抽出尼龙线,恢复再灌注。大鼠苏醒后进行大鼠神经损伤严重缺损评分:0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向左侧转圈;3分:向左侧倾倒;4分:不能自发行走,甚至意识丧失,5分:死亡。取2～3分者为试验对象。假手术组:仅行颈部正中切口暴露右颈总动脉后缝合皮肤。

1.5 UCB-MSCs尾静脉移植 选取生长良好传代脐血间充质干细胞,移植前加入500 μ mol/L的BrdU孵育24 h,用0.25%胰蛋白酶室温消化后加入培养液制成细胞悬液,加入含糖PBS,1200 rpm离心5 min,洗涤2次,将细胞浓度调整为2×106/mL。模型制作完成后1 d、4 d进行尾静脉注射移植,移植组:经尾静脉注入BrdU标记的MSCs细胞悬液1 mL。假手术组和对照组:经尾静脉注射不含MSCs的PBS 1 mL。于2次移植后7 d、14 d对移植组及对照组大鼠进行进行神经功能评分,其后麻醉动物,迅速开胸暴露心脏,经升主动脉插管,多聚甲醛溶液灌注固定,断头取脑,从额部至枕部分为等份,取中间脑片石蜡包埋,组织常规切片,免疫细胞化学法检测BrdU阳性细胞,T UNEL法检测海马组织神经细胞凋亡。具体操作步骤按试剂盒说明书进行,凋亡细胞以细胞胞核呈棕黄色着色为阳性细胞。每张免疫组化切片中采集10个具有代表性的高倍镜非重叠视野,计算均值。

1.6 统计学处理 使用SPSS 11.5统计软件包处理数据。计量资料用(±s)表示,根据实验设计要求采用独立样本t检验和单因素方差分析,以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 UCBMSCs分离与鉴定 脐血间充质干细胞分离效率较低,本研究共分离40份脐血,有6份分离出UCB-MSCs并能够达到融合传代,分离效率为15%。初次接种的细胞小而圆,呈悬浮状态,24 h后开始有细胞贴壁,最初贴壁的MSCs散在、稀少,细胞呈椭圆形或纺锤形,悬浮细胞逐渐坏死破碎,3 d后更换培养基去掉未贴壁的细胞后继续培养,可见少量贴壁细胞,呈单个或几个细胞的克隆,有粗大突起伸出,5～7 d出现大量的贴壁细胞以间充质细胞为主。经多次传代,UCBMSCs呈漩涡状排列。细胞免疫化学染色显示: CD34阳性细胞数均为1.8%,CD44阳性细胞数为98.2%,细胞数量和质量能够满足实验要求。

2.2 移植UCBMSCs在脑内分布 免疫组织化学法检测脑组织中标记的BrdU阳性UCBMSCs表明,移植组7 d、14 d时有少量UCB-MSCs分布于梗死区周围及海马区,左侧正常脑组织中偶见。

2.3 UCBMSCs移植后2组大鼠神经功能评分对比 见表1。2组移植后神经功能均逐渐改善,对照组7 d时与0 d时神经功能略改善,统计学无差异(t=2.236,P＞0.05),14 d时与0 d时神经功能明显改善(t=5.00,P＜0.05)。移植组7 d、14 d时神经功能改善更明显(t7=5.00,t14=6.325,P＜0.05),但与对照组比较统计学无显著性差异(t7=-0.791, t14=-0.791,P＞0.05)。

表1 2组大鼠不同时间点神经功能评分比较 (±s)

表1 2组大鼠不同时间点神经功能评分比较 (±s)

注:与0 d比较,*P＜0.05

?

2.4 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡数比较 见表2。

表2 各组大鼠7 d、14 d时凋亡细胞数比较 (个/HP,±s)

表2 各组大鼠7 d、14 d时凋亡细胞数比较 (个/HP,±s)

注:与假手术组比较,*P＜0.05;与对照组组比较,#P＜0.05

?

3 讨论

MSC移植治疗脑缺血疾病是目前细胞移植治疗研究中最活跃的领域之一。Chen J等[2]对骨髓MSCs移植治疗MCAO卒中大鼠进行系列研究,从不同的途径(经颈动脉、经尾静脉、经脑内)将MSC注入的大鼠体内,发现MSCs移植能够显著降低神经系统的功能损害。但是随着年龄的增长骨髓MSCs的数量、扩增和分化能力也出现明显下降的趋势[3],采集时对患者或供者仍有一定的损伤。近年来研究表明脐血中也含有丰富的MSCs[4-5],可以向三个胚层来源的细胞分化。脐带血来源的MSCs优势主要在于:(1)脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集,其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单,对于新生儿及产妇没有任何痛苦和不良影响,而易于接受,也不会涉及社会、伦理及法律方面的更多争论; (2)脐血受胎盘屏障的保护,其成分被病毒、细菌污染的概率低。脐血中MSCs较少,分离效率较低。本研究共分离40份脐血,有6份分离出UCB-MSCs并能够达到融合传代,分离效率为15%,仍需进一步优化实验条件。

李建斌等[6]通过静脉注射经荧光DIL标记的UCBMSCs在健康小鼠体内各个器官分布情况:肝脏56%、脾脏26%、肺脏8%、肾脏6%、心脏3%、脑1%;在脑卒中小鼠模型体内分布情况:肝脏52%、脾脏24%、肺脏9%、肾脏6%、心脏4%、脑5%。表明脑卒中发生后,病变脏器组织的数量增加。本研究也观察到梗死侧脑组织标记细胞明显增多,分析与血脑屏障开放和梗死后炎症因子招募有关,也是MSC移植治疗脑缺血疾病的基础。

神经细胞凋亡是脑缺血性损伤的重要机制,通过各种途径阻止细胞凋亡可以减轻脑损害。本研究表明未进行UCBMSCs移植的对照组大鼠近期神经功能也有一定程度改善,分析与脑的可塑性和自然修复有关。移植组改善更明显,神经细胞凋亡数明显减少,分析UCBMSCs通过增加缺血组织的生长因子,减少缺血半暗带细胞凋亡而改善神经功能,但与对照组同时间点比较差异无统计学意义,分析与定植在损伤脑组织的UCBMSCs数量过少有关。UCBMSCs还是理想的种子细胞和基因转移载体,移植治疗缺血性脑损伤的途径、剂量及方法尚需进一步研究。

[1] Thalmeier K,Meissner P,Moosmann S,et al.M esenchy mal differentiation and organ distribution of established human stromal cell lines in NOD/SCID mice[J].Acta Haematol, 2001,105(3):159-165.

[2] Chen J,Zhang ZG,Li Y,et al.Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats[J].Circ Res,2003, 92:692-699.

[3] D'Ippolito G,Schiler PC,Ricordo C,et al.Age-relatd osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow[J].J Bone Miner Res,1999,14(7):1 115-1 122.

[4] Goodwin H,Bicknese A,Chien S,et al.M ultilineage differen-tiation activity by cells isolated from umbilical cord blood:expression of bone,fat,and neural markers[J].Biol Blood Marrow T ransplant,2001,7:581-588.

[5] Lee OK,Kuo TK,Chen WM,et al.Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood[J].Blood, 2004,103(5):1 669-1 675.

[6] 李建斌,焦红亮,单泓,等.脐血间充质干细胞在脑卒中小鼠模型主要器官分布研究[J].中国输血杂志,2010,23(10):870-871.