梅花鹿TGF-β1基因的克隆及序列分析

陈斌，徐细建，李馨

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）

人转化生长因子β1（TGF-β1）全基因约为100 kb，由8个外显子和7个内含子组成，翻译后产物为390个氨基酸。TGF-β1是转化生长因子家族的重要成员，具有促进细胞增殖分化的作用，对骨细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。另外TGF-β1对细胞外基质的形成、肿瘤发生和免疫系统方面具有重要的调节作用[1-2]。

功能基因的克隆测序和定位已成为动物遗传育种研究的热点之一。但是，目前对于鹿科动物TGF-β1基因方面的报道却很少，在网上也只公布了牛的TGF-β1基因全序列和羊的外显子序列。研究利用牛TGF-β1基因全序列和羊的7、8外显子序列设计了特异性引物，对梅花鹿TGF-β1基因部分片段进行了克隆测序分析，旨在为梅花鹿的遗传育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

在黑龙江省兴凯湖鹿场随机选取6头健康公鹿，颈静脉采血，置于含有ACD抗凝剂的1.5mL离心管中，于-20℃保存备用。

1.2 实验试剂

DNA凝胶回收试剂盒、小剂量快速质粒DNA提取试剂盒购自Omega公司，rTaq聚合酶、限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司，pMD18-T Vector购自Takara公司。

1.3 DNA提取和检测

梅花鹿基因组DNA按照《分子克隆实验指南》[3]方法提取，并溶于TE中，-20℃保存。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度，稀释备用。

1.4 引物设计

由于GenBank中不能查到关于鹿的TGF-β1基因的全序列，因此根据与鹿科动物比较相近的牛（NC_007316）的TGF-β1基因全序列和羊（X76916）TGF-β1基因部分序列进行序列比对后，使用oligo6.22软件跨7、8外显子设计1对引物，扩增片段长度为839bp。引物序列如下：

F：（5’-3’）GACCTGGGCTGGAAGTGGA；

R：（5’-3’）CCGGGTTGTGCTGGTTGTA。

1.5 PCR扩增

扩增体系组成：共25μL体系，其中包括：灭菌去离子水 16.75μL，DNA模板 2.0μL，10×buffer 2.5μL，2.5 mmoL·L-1的dNTP 2.5μL，10p moL·L-1的上下游引物各0.5μL，0.5 U/μL的rTaq酶0.25μL。

引物的扩增反应循环参数：95.0℃预变性5min；之后30个循环：95.0℃变性30 s，63.8℃复性40 s，72.0℃延伸40 s；最后72.0℃延伸10min。

1.6 PCR产物的克隆测序

取50μL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，把含有目的条带的胶割下，用凝胶回收试剂盒纯化回收。取回收产物4.5μL加入到0.5μL pMD18-T Vector载体中，然后加入Ligation SolutionⅠ5μL混匀，在16℃的水浴锅中连接12 h。将10μL连接产物转化到150μL的DH5α感受态宿主菌中，取100μL转化产物涂在含氨苄（质量浓度100μg·mL-1）的LB平板上，挑取经PCR鉴定后的阳性白色菌斑培养。用试剂盒抽提质粒，经酶切鉴定后送上海英骏公司进行测序。测定的结果与其它哺乳动物的TGF-β1基因序列进行比较。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

从鹿茸血中分离得到总DNA，通过PCR方法获得了大小为839 bp的DNA片段。电泳结果见图1。

2.2 PCR产物的克隆及阳性菌落的鉴定

将目的片段连接到pMD-18T载体上，通过蓝白斑筛选，分别通过PCR鉴定和双酶切（EcoRI和HindⅢ）鉴定，结果证实已得到正确的克隆。电泳结果分别见图2、图3。

图1 引物PCR扩增结果Fig.1 Amplifying resultof PCR注：M为marker（DL2000），1-4为PCR扩增产物

图2 阳性克隆质粒的PCR鉴定Fig.2.Identification of PCR positive cloning plasmid注：M为marker（DL2000），1-8为质粒PCR产物

图3 阳性克隆质粒的酶切鉴定Fig.3.Identification of Positive cloning plasmid enzymes cut注：M为marker（DL2000），1为对照，2为质粒酶切产物

2.3 梅花鹿TGF-β1基因部分核苷酸序列的测定

经上海英骏公司测定，梅花鹿TGF-β1基因部分序列的长度为839 bp，包括2个外显子的部分序列和1个内含子的全序列。该结果已被提交到GenBank上。

2.4 梅花鹿TGF-β1基因部分核苷酸序列的同源比较和分析

将所测序列通过GenBank中的Blast比较分析，表明梅花鹿TGF-β1基因与牛的同源性为92%，与羊的同源性为94%。

3 讨论

TGF-β1是具有多种生物学功能的细胞因子，广泛存在于正常组织、细胞和转化细胞中。TGF-β1基因的表达在转录、翻译和释放环节存在调节功能基因的作用[4]。TGF-β1在骨组织中含量较为丰富，在骨形成和重建过程中起到协调间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞活动的重要作用。TGF-β1可以显著提高软骨细胞表型，促进培养软骨细胞表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖，诱导间充质细胞化为软骨细胞[5]。Tanaka等将TGF-β1作用于大鼠颅骨骨膜后发现，增殖的主要细胞是前成骨细胞并可诱导发生膜内化骨，加速骨的生长[6]。TGF-β1还可抑制骨髓培养中破骨细胞的形成及其活性，从而抑制骨吸收[7]。鹿茸角再生发育后，间充质细胞、前软骨细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞进行分化和增殖，各层组织的细胞也相互转化，处在一个动态的平衡中，维持着鹿茸的成长发育[8]。有研究表明[9]，TGF-β家族mRNA在梅花鹿茸角中表达，在刺激皮肤表皮基层细胞与真皮成纤维细胞的增值、促进软骨膜及间充质细胞向软骨细胞分化、维持鹿茸软骨细胞的快速增殖及抑制过早骨化等过程中起重要的调节作用。那么，在梅花鹿的选育中，通过研究TGF-β1基因并探讨TGF-β1基因多态性与鹿茸生长性能的关系，达到提高鹿茸产量的目的，也将成为我们关注的另一重要研究内容。

梅花鹿作为主要的茸用鹿种，其应用前景是非常广阔的。尽管目前其选育水平还只停留在人工选育阶段，但是已经开始研究利用分子标记对梅花鹿进行标记辅助选择。杜智恒等[10-11]对梅花鹿GH基因和IGF I基因分别进行了克隆测序，为梅花鹿产茸性状的研究提供了理论数据。研究利用PCR技术，对梅花鹿的TGF-β1基因进行了克隆测序，并且将该序列提交到了GenBank上。通过序列比较，梅花鹿与牛、羊之间同源性均高于90%，这说明TGF-β1基因在物种进化过程中保守性很高，在动物生命活动中起到很重要的作用。

试验只是对TGF-β1基因进行了初步的探索，期望能够获得梅花鹿TGF-β1基因的全序列，并进一步开展该基因多态性与产茸性状的相关性研究。

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［5］Blaney Davidson EN，Vitters EL，van der Kraan PM，et al.Expression of TGF～beta And the TGF～beta signaling molecule SMAD～2P in spontaneous and instability～induced osteoarthritis Role in cartilage degradation，chondrogenesis and osteophyte formation［J］.Ann Rheum Dis.2006，26.

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［8］岳占碰，邓旭华，冯海华，等.鹿茸角发育于再生机理［J］.经济动物学报，2005（1）：46-50.

［9］韩玉帅，张璐，赵丽红，等.转化生长因子β家族及其受体在梅花鹿茸角中的表达［C］.中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会会议论文集.2010.08：698.

［10］杜智恒，白秀娟.梅花鹿生长激素基因的克隆及序列分析［J］.经济动物学报，2004，8（3）：131-134.

［11］杜智恒，王宇祥，白秀娟.梅花鹿胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF1）基因的克隆及序列分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2007（5）：98-99.