补体和膜攻击复合物在脉络膜新生血管形成中的作用

许 琴 肖煜晨

老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是随年龄增长而发生、发展的老年人常见的一种致盲眼病,好发于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)-Bruch膜-脉络膜毛细血管复合体以及视网膜外层的退行性病变。AMD分渗出性和干性两型,渗出性 AMD以脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)为特征。CNV穿过Bruch膜进入视网膜下,导致视网膜脱离、中心视力丧失[1]。CNV的发病机制尚未完全明了,人体和实验动物体内的各种补体与年龄相关的黄斑退化关系紧密[2]。膜攻击复合物(membrane attack complex, MAC)是激活的补体级联终产物,国外报道在糖尿病眼组织补体MAC沉积增加,可诱导生长因子释放,刺激血管壁细胞增殖,促进血管增生性疾病的发生发展[3]。MAC是否参与CNV的形成及其作用国内报道尚少。我们用激光击破Bruch膜诱导动物CNV模型[4],探讨补体及MAC在CNV发生中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与分组 雄性 C57BL/6小鼠 72只, C3-/-小鼠21只(4～6周,The Jackson实验室)。共聚焦显微镜LSM510(Carl Zeiss),FITC-葡聚糖(FITC-dextran,Sigma公司),抗山羊CY3抗体(Sigma公司),单克隆特定抗弹性蛋白抗体(Sigma公司), 10 g·L-1Cyclogyl、托吡卡胺、氯胺酮、二甲苯胺噻嗪、眼镜蛇毒(Quidel),兔多克隆MAC抗体,FITC-结合抗兔IgG抗体(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 激光诱导小鼠CNV形成

1.2.1.1 实验分组 对照组C57BL/6小鼠(n= 21)。眼镜蛇毒素(cobra venom factor,CVF)预处理组(n=21):激光光凝前2 d,C57BL/6小鼠25μg CVF腹腔注射,激光光凝后每天同剂量注射至激光光凝后第6天。C3-/-小鼠组(n=21)。氪红激光光凝(光斑直径50μm,曝光时间0.05 s,输出功率为250mW),左眼激光光凝 5～8次,光凝后有气泡示Bruch膜破裂。

1.2.2 观察CNV发生率及大小

1.2.2.1 FITC-dextran心内荧光素灌注 激光光凝后第7天麻醉小鼠(每组6只),1 mL含50μg FITC-dextran PBS(pH 7.3)灌注心脏。

1.2.2.2 剥离RPE-脉络膜-巩膜 处死小鼠,体积分数为 10%福尔马林液固定眼球,解剖显微镜下去除角膜和晶状体、玻璃体。显微镜下将RPE-脉络膜-巩膜复合体呈 5～6条放射状切开。

1.2.2.3 抗体标记Bruch膜及RPE RPE-脉络膜-巩膜在体积分数为5%牛血清白蛋白中孵育 1 h后, PBS漂洗,滴加单克隆特定抗Elastin抗体(1.0 g· L-1;1∶200稀释,Sigma-Aldrich),并置于湿盒内,缓慢摇床上4℃过夜(避光),PBS漂洗,每次间隔5 min;加入二抗抗山羊CY3抗体(1.0 g·L-1,1∶2 000稀释)于37℃湿盒避光孵育2 h,PBS漂洗。

1.2.2.4 观察CNV 激光光凝后第7天,RPE-脉络膜-巩膜复合体铺片,共聚焦显微镜下观察CNV的发生率,在激光光斑处CNV复合物为绿色,视网膜与Bruch膜呈红色。

1.2.2.5 免疫组织化学分析 标记RPE-脉络膜-巩膜复合体的MAC。每个实验组(n=15),激光光凝后第1天、第3天、第5天和第7天后被处死,RPE-脉络膜-巩膜复合体铺片滴加兔多克隆抗体(1∶200稀释) 37℃孵育2 h,PBS漂洗后,加入二抗FITC-结合抗兔IgG抗体(1∶200稀释)于37℃孵育1 h,PBS漂洗。

1.2.3 补体的溶血活性(CH50)检测 分别收集经腹腔注射CVF后的第1天、第3天、第5天和第7天(n=15)及对照组小鼠血液(n=15),EZ补体CH50实验(Diamedix)检测补体活性。150μL抗体敏感的绵羊红细胞与鼠血清梯度稀释,在 37℃下孵育 60 min。

1.3 统计学分析 本研究使用SPSS 13.0软件,组间比较采用 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼底改变 雄性C57BL/6小鼠激光后光斑中央有气泡形成,光凝后观察眼底见光斑中央为白色。

2.2 CH50检测结果 CVF处理组的C57BL/6小鼠补体与对照组的C57BL/6小鼠相比,其CH50水平在光凝后第 1天、第 3天、第 5天和第 7天分别为3%、3%、3%和2%,相同时间点对照组的CH50水平均为100%,差异有显著统计学意义(均为 P＜0.001)。结果表明CVF耗尽C57BL/6小鼠体内补体。

2.3 观察实验组激光诱导CNV复合物 经FITC-dextran灌注心脏,RPE-脉络膜-巩膜复合体标记呈红色,共聚焦显微镜检测铺片,证实光凝后第 7天,对照组小鼠光斑中央有CNV长出(绿色),发展为实验性CNV,由扁平血管构成宽大的网状结构(图1),可观察到实验性CNV与周围脉络膜之间的交通血管。CVF预处理组及缺乏补体C3的 C3-/-小鼠组激光不能诱导CNV的生成(图2-图3)。

2.4 CNV复合物区域MAC的沉积 对照组C57BL/6小鼠激光后第 1天、第 3天、第 5天、第 7天RPE-脉络膜-巩膜复合体铺片见MAC红色强阳性染色(图4)。CVF预处理组C57BL/6小鼠和C3-/-小鼠组,激光后第1天、第3天、第5天、第7天,RPE- 脉络膜-巩膜复合体铺片未见MAC染色(图5-图6)。

Figure 1 Confocalm icrograph in C57BL/6m ice showed the growth of CNV in control group at the 7th day after laser photocoagulation(The CNV complex stained green,Bruchmembrance and RPE stained red).Figure 2 CNV did notappear in C 57BL/6m ice in CVF-treated group at the 7th day after laser photocoagulation.Figure 3 No CNV appeared in C3-/-group at the 7th day after laser photocoagulation 图1 激光光凝后第7天,共聚焦显微镜下见激光诱导的对照组C57BL/6小鼠CNV生长(CNV复合物呈绿色,Bruch膜及RPE呈红色)。图2 激光光凝后第7天,CVF预处理组C 57BL/6小鼠未见CNV生成。图3 激光光凝后第7天,C3-/-组小鼠未见CNV生成

Figure 4 Staining for MAC in laser spots(CNV area,especially in RPE)were red in C57BL/6m ince in control group after laser photocoagulation. Figure 5 No staining for MACwas observed in C57BL/6mice in CVF-treated group after laserphotocoagulation.Figure 6 No staining for MACwas observed in C3-/-group after laser photocoagulation 图4 对照组C 57BL/6小鼠激光光凝后激光光斑(CNV区域尤其是RPE)MAC呈红色。图5 CVF预处理组C 57BL/6小鼠,耗尽补体,激光光凝后未观察到MAC染色。图6 C3-/-组小鼠激光光凝后未观察到MAC染色

3 讨论

AMD是老年人永久性中心视力丧失的主要原因[1]。CNV是渗出性AMD的一种标志,CNV的病因及发病机制尚不明确,可能与增龄性改变、缺氧、缺血、血管生成因子、Bruch膜损伤或细胞外基质改变等多种因素有关。有报道称局部炎症和免疫反应引起促新生血管因子增加,导致了 CNV的发生[5],补体C5b-9复合物参与 CNV的形成[6],人体和实验动物体内的各种补体与 AMD关系紧密[2]。补体MAC是激活的补体级联终产物。在CNV疾病中,补体MAC是否参与CNV的形成及作用机制国内未见报道。诱发动物 CNV形成的可靠方法之一是激光光凝使Bruch膜破裂。在本研究中,我们用激光诱导实验鼠CNV模型探讨了补体MAC在CNV生成中的作用。

我们在激光诱导的CNV小鼠模型中观察到补体充足的C57BL/6小鼠有CNV形成,而通过用眼镜蛇蛇毒因子耗尽补体的C57BL/6小鼠CNV的生成受到严重抑制;我们又发现激光不能诱导缺乏补体的C3-/-小鼠CNV的生成。这表明,补体存在和活化是激光诱导小鼠 CNV生成的必要条件。正常情况下MAC会自发地、少量沉积在自身组织,而病理条件下MAC大量沉积在自身组织。本研究中,我们用激光诱导补体充足的C57BL/6小鼠建立CNV模型,研究发现在新生血管病变区域有大量的 MAC沉积,在新生血管复合物观察到 MAC强染色。相反,激光对 C3-/-小鼠以及 CVF处理的补体耗尽的C57BL/6小鼠,未见MAC染色。这些结果表明补体的存在和MAC沉积、激光诱导的CNV生成三者相互关联。MAC是补体级联激活的终产物,国外报道MAC可释放血管生长因子如VEGF、β-FGF、TGF-β;由MAC介导的有核细胞释放的细胞生长因子可能是血管生成的致病机制[7];补体激活抑制剂rsCD59a-Fc通过阻止MAC沉积和血管生长因子(VEGF、β-FGF、TGF-β2)释放途径抑制激光诱导CNV生成;眼镜蛇蛇毒因子耗尽补体 CVF[8]导致血管生长因子水平显著下降。这些报道与我们的结果显示:补体的存在和活化,尤其是MAC的形成是激光诱导小鼠 CNV形成的重要途径。补体活化和MAC形成是激光诱导CNV生成的第一个直接的作用。

由以上可知,我们推测补体在CNV中可能的作用机制是补体通过经典或替代途径激活导致MAC在RPE和(或)脉络膜大量的形成和沉积。补体被激活的具体通路不知。激光诱导小鼠 CNV中补体激活具体途径有待深入研究探讨。

1 Tezel TH,Bora NS,Kaplan HJ.Pathogenesis of age-related macu lar degeneration[J].Trends Mol Med,2004,10(9):417-420.

2 Sivaprasad S,Adew oyin T,Bailey TA,Dandekar SS,Jenkins S, Webster AR,et al.Estimation o f systemic complem ent C3activity in age-related macular degeneration[J].A rch Oph tha lm ol, 2007,125(4):515-519.

3 Zhang J,Gerhard inger C,Lorenzi M.Early com plemen t activation and decreased levels of glycosylphosphatidylinosito l-anchored comp lement inhibitors in hum an and ex perimental diabetic retinopathy[J].Diabetes,2002,51(12):3499-3504.

4 Bora PS,Kaliappan S,Xu Q,Kumar S,Wang Y,Kap lan HJ,et al. Alcoho l linked to enhanced angiogenesis in ratm odel of choro idal neovascularization[J].FEBS,2006,273(7):1403-1414.

5 李 瑾,郝玉华,赵 欣.炎症和脉络膜新生血管关系的研究进展[J].眼科新进展,2010,30(3):293-296.

6 马敏旺,陈 松,李文博,钱江源,马修彬.补体C 5b-9复合物对人视网膜色素上皮细胞VEGF表达的影响[J].天津医药,2009,37 (2):114-116.

7 Benzaquen LR,Nicholson-Weller A,Halperin JA.Term inal comp lement pro teins C 5b-9 release basic fibroblast grow th facto r and platelet-derived grow th facto r from endothelial cells[J].J Exp Med,1994,179(3):985-992.

8 Shike T,Isom e M,Mizuno M,Suzuk i J,Matsuo S,Yamam oto T, et a l.Im plication of the comp lement system in the induction of an ti-glom erular basem en tmemb rane glomerulonephritis in WKY rats[J].Pa thol In t,2003,53(11):757-761.