益气活血法对兔视网膜激光损伤后bFGF和GFAP表达的影响△

江运长 彭清华 杨 霞

视网膜激光光凝术已成为治疗糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等常见眼底病的重要手段，并取得较好的治疗效果。但是，视网膜激光光凝在发挥其治疗作用的同时，本身也是一种病理过程，可对视网膜的正常结构和功能造成一定的影响，导致视网膜激光损伤。因此需要研究视网膜激光光凝的辅助性疗法，以期减轻眼底激光治疗的副作用，促进损伤修复，增强其疗效。我们采用兔视网膜激光损伤模型作为研究对象，研究益气活血法对眼底激光视网膜损伤的促修复作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康有色家兔50只，雌雄不限，体质量为2.0～2.5 kg，均由湖南中医药大学动物实验中心提供，使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》，所有动物检查均无眼部疾病。

1.2 主要药品与仪器 黄芪水煎液(生药浓度: 1 kg·L-1)、蛴螬水提液(生药浓度:0.25 kg· L-1)、益气活血方(黄芪、当归、红花等)水煎液(生药浓度:1 kg·L-1);胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)一抗、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)一抗(武汉博士德生物工程有限公司);S-P免疫组织化学染色超敏试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);Imaging ProPlus图像分析系统(美国Media Cybernetic公司);光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社);眼底激光治疗仪(法国光太公司)。

1.3 造模方法 参照覃冬菊等［1］提出的方法，并加以改进。采用倍频532 nm绿激光对有色家兔眼进行损伤照射造模。照射前，实验动物用5 g·L-1复方托品酰胺滴眼液滴眼散瞳，250 g·L-1乌拉坦4 mL·kg-1耳缘静脉注射麻醉。每眼照射40个损伤斑。光斑直径50 μm，照射功率110 mW，曝光时间0.15 s。

1.4 分组及给药方法 50只家兔随机分成正常对照组、模型对照组、黄芪组、蛴螬组、益气活血组，每组10只。黄芪组每天给予黄芪水煎液5 mL·kg-1灌胃;蛴螬组每天给予蛴螬水提液5 mL·kg-1灌胃;益气活血组每天给予益气活血方水煎液5 mL·kg-1灌胃;正常对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃。于造模后第2天开始灌胃，每天1次。

1.5 观测指标 bFGF、GFAP表达的免疫组织化学观察:切片经常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后，采用S-P免疫组织化学法检测视网膜组织bFGF、GFAP的表达。DAB显色，苏木素复染，常规脱水，封片。正常对照组与模型对照组省去滴加bFGF、GFAP一抗的步骤。

2 结果

2.1 益气活血法对bFGF表达的影响 术后第7天，正常对照组视网膜组织切片bFGF呈阳性表达(图1)。模型对照组、黄芪组、蛴螬组阳性表达范围均较正常对照组小(图2-图4)。益气活血组bFGF阳性表达范围较模型对照组、黄芪组、蛴螬组大(图5)。正常对照组、模型对照组、黄芪组、蛴螬组及益气活血组视网膜bFGF表达的灰度值分别为84.54± 15.16、134.00±15.94、128.72±12.47、128.94± 9.50及105.16±5.17。模型对照组视网膜组织bFGF表达与正常对照组比较明显减少(P＜0.05);与其他激光损伤组比较，益气活血组bFGF表达均明显增强(均为P＜0.05)，但还未恢复到正常对照组水平。提示益气活血方剂可以增加内源性bFGF的表达，从而发挥其保护作用。

Figure 1 The positive expression of bFGF in the normal control group(×400).Figure 2 Compared with the normal control group，the expression of bFGF in model group decreased(×400).Figure 3 Compared with the normal control group，the expression of bFGF in astragalus group decreased (×400).Figure 4 Compared with the normal control group，the expression of bFGF in grub group decreased(×400).Figure 5 Compared with the other injury groups，the expression of bFGF in yiqihuoxuefang group increased(×400) 图1 正常对照组视网膜组织切片bFGF呈阳性表达(×400)。图2 模型对照组bFGF表达较正常对照组弱(×400)。图3 黄芪组bFGF表达较正常对照组弱(×400)。图4 蛴螬组bFGF表达较正常对照组弱(×400)。图5 益气活血组bFGF表达较其他激光损伤组强(×400)

术后第14天，正常对照组视网膜组织切片bFGF呈阳性表达，与术后第7天相比，无明显区别。模型对照组、黄芪组、蛴螬组 bFGF继续呈阳性表达。益气活血组bFGF阳性表达持续，阳性表达范围仍然较模型对照组、黄芪组、蛴螬组增加。正常对照组、模型对照组、黄芪组、蛴螬组及益气活血组视网膜bFGF表达的灰度值分别为81.30±18.11、136.00± 14.41、122.00±6.64、126.98±7.97及102.12±7.79。模型对照组视网膜组织bFGF表达与正常对照组比较明显减少(P＜0.05);与其他激光损伤组比较，益气活血组bFGF表达明显增强(均为P＜0.05)，但还未恢复到正常对照组水平(P＜0.05)。提示益气活血方剂可以增加内源性bFGF的表达，继续发挥其保护作用。

2.2 益气活血法对GFAP表达的影响 术后第7天，正常对照组视网膜组织切片Müller细胞的GFAP呈阴性表达，星型胶质细胞 GFAP呈阳性表达(图6)。模型对照组、黄芪组、蛴螬组GFAP呈阳性表达，阳性表达范围较正常对照组大(图7-图9)。益气活血组GFAP阳性表达范围较正常对照组大，但较模型对照组、黄芪组、蛴螬组小(图10)。正常对照组、模型对照组、黄芪组、蛴螬组及益气活血组视网膜GFAP表达的灰度值分别为141.72±12.30、91.44±13.39、90.22±15.59、84.14±25.04及119.08±6.92。模型对照组视网膜组织GFAP表达与正常对照组比较明显增强(P＜0.05);与其他激光损伤组比较，益气活血组GFAP表达明显减少(均为P＜0.05)，但较正常对照组明显增强(P＜0.05)，提示益气活血方剂有利于激光视网膜损伤的适度修复。

Figure 6 The positive expression of GFAP in the normal control group(×400).Figure 7 Compared with the normal control group，the expression of GFAP in model group increased(×400).Figure 8 Compared with the normal control group，the expression of GFAP in astragalus group increased (×400).Figure 9 Compared with the normal control group，the expression of GFAP in grub group increased(×400).Figure 10 Compared with the other injury groups，the expression of GFAP in yiqihuoxuefang group decreased(×400) 图6 正常对照组的GFAP呈阳性表达(×400)。图7模型对照组GFAP阳性表达较正常对照组强(×400)。图8 黄芪组GFAP阳性表达较正常对照组强(×400)。图9 蛴螬组GFAP阳性表达较正常对照组强(×400)。图10 益气活血组GFAP阳性表达较其他激光损伤组弱(×400)

术后第14天正常对照组视网膜组织切片GFAP表达与术后第7天相比，无明显区别。模型对照组、黄芪组、蛴螬组GFAP呈持续阳性表达，阳性表达范围较正常对照组大。益气活血组GFAP阳性表达范围仍然较正常对照组大，但较模型对照组、黄芪组、蛴螬组小。正常对照组、模型对照组、黄芪组、蛴螬组及益气活血组视网膜GFAP表达的灰度值分别为136.68±7.61、92.30±11.79、92.18±15.28、86.66± 22.62及117.66±5.30。模型对照组视网膜组织GFAP表达与正常对照组比较明显增强(P＜0.05);与其他激光损伤组比较，益气活血组GFAP表达明显减少(均为P＜0.05)，但较正常对照组明显增强(P＜0.05)，提示益气活血方剂有利于激光视网膜损伤的适度修复。

3 讨论

眼底激光光凝视网膜可以造成视网膜激光损伤。眼激光损伤药物防治的研究水平尚停留在动物实验阶段，还没有进行临床应用研究［2］，所以，激光视网膜损伤的治疗目前尚无特异性的药物。在本实验部分，我们试图通过免疫组织化学法来初步了解益气活血法对眼底激光视网膜损伤修复的干预作用和相应机理。我们发现，益气活血方剂能够增强视网膜组织中bFGF的表达、抑制GFAP的表达。

bFGF促进损伤修复的作用已趋于肯定。研究表明，视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞能合成bFGF，其在视网膜的发育与生长中起着重要作用［3］。bFGF对光感受器具有重要的保护作用，强光照射和机械损伤均可引发这种保护作用。单清等［4］通过观察比较bFGF、地塞米松和维生素C对动物视网膜激光损伤的治疗效果，发现bFGF能维持神经元和胶质细胞的功能，加速视网膜损伤斑的修复愈合以及视功能的恢复。由于bFGF治疗后有更多的光感受器存在，揭示其可能在维持光感受器方面有直接作用。本实验表明，益气活血方剂可以促进内源性bFGF的分泌，有利于发挥bFGF对光感受器的保护作用，从而减轻激光对视网膜的损伤。

GFAP常被作为胶质细胞的特征性标记物应用于免疫研究。研究表明，Müller细胞的GFAP表达与激光光凝损伤程度成正相关［5］。视网膜损伤发生后，Müller细胞增生旺盛，其GFAP合成的量和表达范围显著增加。Müller细胞的这种过度增生和肥大将影响光感受器细胞的再生，导致视网膜自身纤维化，阻碍了视网膜组织结构的恢复，从而不可避免地对视功能的恢复产生不利影响。本实验发现，益气活血方剂可以减少GFAP表达的量及范围，提示其能抑制Müller细胞对损伤的过度修复，起到保护视细胞再生与恢复所需的空间，从而为激光视网膜损伤得到更好的修复提供形态结构上的支持。

Humphrey等［5］用视网膜光凝法对视网膜造成损伤后，发现了GFAP含量升高而bFGF含量降低的病理改变。由于bFGF抑制视网膜神经元的细胞凋亡、维持光感受器的生存而减少，随之Müller细胞增殖促使视网膜的修复，表现为GFAP表达的增强。本实验表明，益气活血方剂可以同时增加bFGF的表达和减少GFAP的表达，因而能够改变以上的病理表现，进而改变激光视网膜损伤的修复进程，达到更高层次的修复。

益气活血法可能通过增强视网膜组织中bFGF的表达、抑制GFAP的表达，促进眼底激光视网膜损伤的修复，对视网膜激光光凝损伤有一定的防治作用，可以考虑作为视网膜激光光凝的辅助性疗法。

1 覃冬菊，唐罗生，刘湘平，唐朝珍.兔视网膜光凝术后组织形态学改变的动态观察［J］.国际眼科杂志，2008，8(5):909-912.

2 李 哲，蒋铭敏.激光眼损伤治疗药物的研究进展［J］.激光杂志，2006，27(3):3-4.

3 李 臻.视网膜色素上皮细胞相关细胞因子［J］.眼科新进展，2004，24(3):234-237.

4 单 清，任 华，张 杰，焦振宇，钱焕文.激光视网膜损伤治疗的实验研究［J］.激光生物学报，2001，10(2):124-127.

5 Humphrey M，Chu Y，Mann K，Rakoczy P.Retinal GFAP and bFGF expression after multiple argon laser photocoagulation injuries assessed by both immunoreactivity and mRNA levels［J］. Exp Eye Res，1997，64(3):361-369.