中药提取液对鸡传支病毒的效果研究

张素辉，曹国文，陈春林，邱进杰

（重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460）

为了观察项目组研制的三个中药组方对预防和治疗鸡传染性支气管炎的安全性和有效性，本试验采用IBV-M41标准株感染鸡胚，观察其作用效果，为临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 中药提取液 依据麻杏石甘散进行组方加减，

得到三个中药组方。采用蒸馏法和水提醇沉法提取，并经10000r/min高速离心取上清液制得。

1.1.2 种毒 鸡传染性支气管炎病毒（IBV-M41株），购自中国兽药监察所。

1.1.3 实验鸡胚 9日龄SPF鸡胚，购自山东济南某家禽科技有限公司。

1.1.4 试剂及仪器 试剂包括生理盐水、10 000IU/mL双抗等。仪器包括孵化箱、高压灭菌锅、离心机、无菌操作台、水浴锅。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒复壮 IBV-M41株使用前用鸡胚复壮，种毒按1∶1000稀释，经尿囊腔接种于9日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL。37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液，加入10%10000IU/mL双抗混匀，以2000r/min离心15min，取上清作为病毒感染液备用。

1.2.2 IBV-M41毒株鸡胚半数感染量（EID50）的测定 将IBV-M41毒株用生理盐水按10倍系列连续稀释成8个稀释度，取105至108稀释梯度的稀释液接种于9日龄鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种5枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.1mL，另设4枚鸡胚为空白对照。将鸡胚置于37.5℃孵化箱中孵化，每间隔10h照蛋，记录死胚数和有典型病变的鸡胚数，7d内死亡的随时取出放于4℃冰箱中保存，24h内死亡的胚不计。按Reed-Muench方法计算EID50。

1.2.3 试验设计及分组 将140枚9日龄SPF鸡胚统一在孵化箱中孵化，分别按以下方法分组并处理：

中药提取液安全性测定组：将三个组方的中药提取液用生理盐水分别作100倍稀释后再作连续2倍比稀释，取连续5个稀释度的稀释液接种9日龄鸡胚，每个稀释度接种3枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.1mL，另设2枚鸡胚为空白对照。将鸡胚置于37.5℃孵化箱中孵化，经10 h间隔照蛋，弃去死亡鸡胚。连续观察3 d，每天观察鸡胚发育情况，记录死胚情况。最后根据存活鸡胚数判定中药对鸡胚的毒性，找到无毒性最大浓度，该浓度即为对鸡胚的最大安全浓度。

中药提取液在鸡胚水平上对病毒毒力阻断作用的测定组：将最大安全浓度的中药提取液0.1mL接种于9日龄鸡胚，将鸡胚置于37.5℃孵化箱中作用，分别于2、4、8、16、24h后取出，再将含有200×EID50的病毒液按0.1mL/枚接种于鸡胚。每种方法接种3枚鸡胚，另设3枚鸡胚作空白对照。将鸡胚置于37.5℃孵化箱中孵化，经10h间隔照蛋，弃去死亡鸡胚。连续观察7d，每天观察鸡胚发育情况，记录死胚情况。

中药提取液在鸡胚水平上对病毒毒力抑制作用的测定组：将含有200×EID50的病毒液0.1 mL接种于9日龄鸡胚，将鸡胚置于37.5℃孵化箱中保温，2、4、8、16、24 h后取出，再将最大安全浓度的中药液按0.1 mL/枚接种于鸡胚。每种方法接种3枚鸡胚，另设3枚鸡胚作空白对照。将鸡胚置于37.5℃孵化箱中孵化，经10h间隔照蛋，弃去死亡鸡胚。连续观察7d，每天观察鸡胚发育情况，记录死胚情况。

2 试验结果

从病毒复壮试验中发现，鸡胚接种病毒后36 h，鸡胚发育开始减缓，第3 d出现鸡胚死亡，死亡高峰出现在第5、6 d，7 d后鸡胚死亡率达70%。鸡胚主要表现发育迟滞，胚体矮小，羊膜增厚，卵黄囊缩小，尿囊液增多。

2.1 IBV-M41毒株EID50的测定结果 IBV-M41毒株EID50为0.2mL 10-6.58倍稀释的病毒液，鸡胚整体发育不良，胚体小，畸形。空白对照组全部存活。

2.2 中药提取液安全性测定结果 由表1可知，在同一个稀释梯度：组方1与组方2、组方3相比，其安全性较好，在100×20倍稀释度时对鸡胚发育影响不明显，毒性不大；组方2在100×23倍稀释度时对鸡胚发育无影响，100×20至100×22倍稀释度时对鸡胚发育有致畸作用；组方3在100×20倍稀释度时对鸡胚发育有影响，与对照胚比较，胚体萎缩，个别头部有出血，胚体发育小。

表1 中药提取液安全性测定结果

2.3 中药提取液在鸡胚水平上对病毒毒力阻断作用的测定结果 由表2可知，组方1对IBV-M41株的阻断效果较好，其最佳作用时间为4～16h阶段。

表2 中药提取液在鸡胚水平上对病毒毒力的阻断作用

2.4 中药提取液在鸡胚水平上对病毒毒力抑制作用的测定结果 由表3可知，组方1对IBV-M41株的抑制作用较好，其最佳作用时间为2～8h阶段。

表3 中药提取液在鸡胚水平上对病毒毒力的抑制作用

3 讨论

3.1 用IBV-M41感染SPF鸡胚，7 d致死率达70%，其病变和致死率与文献报道的基本一致，表明人工感染造模成功。

3.2 从试验数据可以看出，组方1提取液能显著阻断和抑制IBV-M41对SPF鸡胚的毒害作用，从而有效地保护鸡胚免受侵害。在对病毒毒力阻断作用进行测定的试验中，先注入中药提取液再在不同时段接种IBV-M41，三个组方中，均为16 h和24 h阶段的死亡率较高，说明该组方在37.5℃的鸡胚中药效代谢较快，在经过16 h后，对IBV-M41株作用减弱；在2、4 h和8 h试验阶段，只有组方1没有死亡鸡胚出现，其他均有不同程度的死亡和弱胚，说明组方1对IBV的阻断效果较好。在对病毒毒力抑制作用进行测定的试验中，先接种IBV再在不同时段注入中药提取液时，三个组方中，均为16 h和24 h阶段的死亡率较高，说明病毒在37.5℃的鸡胚中经过16～24 h孵化后，病毒量达到较高滴度致鸡胚死亡；在2、4 h和8 h试验阶段，只有组方1没有死亡鸡胚出现，其他均有不同程度的死亡和弱胚，说明组方1对IBV的抑制效果较好。

3.3 由试验结果可见，本实验室设计的三个中药组方提取液在鸡胚中对IBV的阻断和抑制试验取得了较满意的结果，以组方1效果最为明显，其中尤以对病毒的阻断作用极佳。其作用机理可能为：中药与鸡胚作用后，中药提取液提高了鸡胚的免疫力，有效阻止了病毒的吸附和侵入。而中药组方对病毒的抑制作用试验中，病毒侵染鸡胚后再添加中药，中药样品对鸡胚内的病毒起一定的抑制作用，抑制了病毒的生物合成及成熟释放。其具体作用机理有待于进一步探明。

3.4 麻杏石甘散中，麻黄具有宣通肺气以平喘，杏仁降气化痰以平喘止咳，二药相合增强了清肺化痰、止咳平喘的作用。石膏清泄肺热，甘草有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、调和诸药等功能。麻杏石甘汤方剂对目前生产中常发的呼吸道疾病有明显的治疗作用，也有抗病毒和抑菌作用。陈玥等研究发现，麻杏石甘提取物对哮喘大鼠有抑制体重减轻，延长引喘潜伏期，恢复机体的白细胞数目及正常分布，降低血及肺组织中ET-1含量，改善肺部支气管组织病理形态学结构等作用。本试验对配方进行加减，并对其提取液的功效加以比较，为鸡传染性支气管炎等病毒性疾病的治疗和预防提供了基础资料。

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