高脂饲料对细鳞鱼稚鱼刷状缘膜水解酶发育的影响

张 辉 牟振波 刘 敏 徐革峰

过去的20多年中，为配制能够替代活饵的人工饲料，对稚鱼消化道形态发育、各类营养物质适宜添加水平以及利用能力方面，进行了大量的研究工作，并为实践应用打下了理论基础。在消化能力的研究上，主要描述消化道水解酶分布与饲料对酶活性以及转运能力的影响。

孵化后的仔鱼表现出特殊的消化特征，此后会逐渐发育为接近成鱼的消化模式。稚鱼的早期发育阶段对于饲料中营养物质的化学性质和含量水平高度敏感。稚鱼对摄食营养物质的同化能力也会依赖于饲料成分、鱼体消化酶和新陈代谢过程的调整能力。因此，消化酶的个体发育研究以及发育过程关键指标的测定，可能会解释饲料成分添加量以及对发育的影响效应。

本研究目的是通过测定刷状缘膜上水解酶的活性变化，分析并评价饲料成分与消化道刷状缘膜水解酶发育之间的关系，以辅助确定饲料中脂类的适宜含量。

1 材料与方法

1.1 材料

稚鱼采自黑龙江水产研究所渤海试验站。

鱼苗开口后，以水蚤投喂15 d。然后以水丝蚓与水蚤混合投喂10 d。此后，按照10尾/l的放养密度进行分池饲养在12个（内设4个小水槽）平列槽中，平均每个平列槽的稚鱼数量为2000尾，每个小水槽的放养量为500尾。试验期间，根据每次采样后的估计数量调节水体体积，使养殖密度保持在10尾/l水平。试验用水是来自于镜泊湖的地下渗出水，经砂滤后使用。试验过程中水温保持在（13±2）℃，溶氧高于5 mg/l。

然后投喂蛋白含量为48%、脂类含量分别为15%、20%、25%和30%的人工饲料。饲料投喂前进行3 d的转口和3 d的适应。对照组投喂水蚤和水丝蚓的生物饵料。试验前期（0～15 d）每天投喂8次，后期每天投喂6次。

取开口15 d投喂生物饵料的稚鱼以及试验不同处理的稚鱼，每10 d采集一次。每次采样40尾，采样前24 h停食。捞取样本后，迅速放入液氮中保存，待分析。

1.2 方法

1.2.1 组织处理与肠道刷状缘膜囊的制备

将液氮中的鱼体在4℃冰水的载玻片上解冻。解冻后的鱼体在冰水保温的条件下，在解剖镜下解剖处理为四部分：头、躯干（含腹部肌肉）、鳃和胃肠道。取出的组织，以重量/体积为1：9比例溶于0.7%的生理盐水中，用匀浆机以10000 r/min匀浆1 min，制成10%组织匀浆。将制备好的匀浆用低温离心机，1000×g离心5 min，离心好的匀浆留上清液弃去沉淀，制成10%的匀浆液。然后，迅速在液氮中冷冻，保存于－80℃温度冰箱中，待分析。

肠道刷状缘膜囊的制备参照Crane等的两步梯度离心方法并加以改进。根据水解酶富集程度判定刷状缘膜囊的纯度。

1.2.2 水解酶活性与蛋白浓度测定

γ－谷氨酰肽转移酶（γ－GT，EC2.3.2.2）测定参见Naftalin等的方法，活性单位以U/mg prot表示；碱性磷酸酶（EC3.1.3.1）活性测定参见Beessey等方法，活性单位以U/mg prot表示；蛋白质浓度测定参照Bradford的方法。

①采用高强度水泥浆补强加固，首先钻2～3个小孔，其作用是当做灌浆和出浆使用，并且孔的深度通常要比缺陷处深至少1m。

1.2.3 体重与成活率测定

取样，用滤纸吸干水分后在电子天平下称重。养殖试验结束后，分别对每一处理的养殖成活率计算，得出4个平行成活率平均值，作为成活率结果。

1.2.4 饲料配方

稚鱼投喂蛋白水平为48%，脂类水平分别为15%、20%、25%和30%的四个处理饲料。以投喂水蚤和水蚯蚓活饵为对照组，每处理四个平行。试验中脂类水平分别用L1、L2、L3和L4代表由低到高的脂类饲料。微颗粒饲料的规格为200～800 μm饲料配方见表1。

表1 饲料配方

1.2.5 统计分析

统计分析采用SPSS10.0，进行F检验的方差分析。

2 结果

2.1 γ－GT活性

γ－GT活性测定结果见表2、图1。

表2 γ－GT 活性测定结果（±SD,n=18）（U/mg prot）

表2 γ－GT 活性测定结果（±SD,n=18）（U/mg prot）

注：数据肩标含不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下表同。

时间（d）项目0对照L1处理L2处理L3处理L4处理2.54±0.8b 2.54±0.8b 2.54±0.8b 2.54±0.8b 2.54±0.8b 103.1±0.5b 2.5±1.1b 4.6±1.1a 5.2±2.1a 2.1±0.9b 202.3±1.1b 2.3±1.0b 4.8±2.0a 8.6±2.1c 5.5±1.2b 303.0±1.8b 4.0±0.6b 4.4±0.7a 9.0±1.9c 2.5±1.6b

图1 γ－GT活性分布与变化趋势

对照组活性变化不大，L1与L4处理相比的活性均有所增加，L1后期活性有明显上升，但与L4相差不显著。L2处理活性有升高，但在后期稳定，与同期各处理相比差异显著。L3的活性呈升高状态，在20 d和30 d时，酶活性趋于稳定，与其它处理相比差异显著（P＜0.05）。这种水解酶活性的增强，说明饲料成分起到了决定性的作用，有利于对饲料的吸收和转运。

2.2 AKP活性

AKP活性测定结果与变化趋势见表3、图2。对照组活性相对稳定，而L1、L2以及L4的活性与对照组相比却略有降低，尤其是L1与L2的活性没有增强，反而出现略微下降，但L1与L2两组间差异并不显著。L1经短期下降后有所升高，而L4呈上升状态，后期活性升高，并高于 L1和 L2，但差异不显著（P＞0.05）。L3的活性表现出稳定的升高，后期的活性要高于其他处理，并保持上升态势，且与其它试验组相比差异显著（P＜0.05），说明水解能力逐渐增强。

表3 AKP 测定结果（±SD,n=18）（U/mg prot）

表3 AKP 测定结果（±SD,n=18）（U/mg prot）

项目 时间（d）0对照L1处理L2处理L3处理L4处理10.86±3.3a 10.86±3.3a 10.86±3.3a 10.86±3.3a 10.86±3.3a 1012.0±3.4a 6.7±2.1b 10.7±2.6b 11.5±3.3a 8.7±2.1b 2011.0±2.0a 8.1±3.6b 8.9±3.7b 13.5±3.3a 9.9±1.6b 3012.7±3.8a 8.2±0.6b 8.8±2.2b 13.8±2.3a 11.7±3.1b

图2 AKP活性分布与变化趋势

2.3 增重与存活率（见表4、表5、图3）

表4 高脂饲料养殖仔鱼增重情况（mg/尾）（±SD,n=40）

表4 高脂饲料养殖仔鱼增重情况（mg/尾）（±SD,n=40）

时间（d）项目0对照L1处理L2处理L3处理L4处理154.6±10.5154.6±10.5154.6±10.5154.6±10.5154.6±10.510216.7±15.4177.8±15.3181.9±19.8233.9±20.9257±22.320285.0±20.1238.5±28.9280.8±24.3279.7±24.3290.8±25.430332.3±24.3301.3±28.7320.3±29.6347.7±30.9316.7±28.9

表5 养殖成活率情况（%）

图3 48%蛋白饲料对细鳞鱼仔鱼生长的影响

从生长结果看，L3生长最好，终体重超过了对照组水平，而前期要稍强于对照。10 d时，L4要好于对照与各处理组，但在以后生长中体增重率降低；L1与L2的结果近似，后期L1生长要弱于L2。终体重以L1最低。

成活率结果显示，L3处理组要好于对照组与所有试验组，但与对照相差不大，而远高于L1和L4。

3 讨论

与哺乳动物相比，对鱼类消化酶研究还很有限。在研究鱼类的投喂方法时必须考虑到对多种饲料的消化能力。消化能力的成熟情况直接会反映出摄食习性与饲料源的利用。

本试验设计研究细鳞鱼稚鱼的脂类营养需求。用配合饲料作为单一的饲料源进行应用是一项正在广泛研究的内容。对海水鱼类仔鱼进行了替代生物饵料的全人工饲料的营养研究，即以15 d的仔鱼为对象，研究饲料对发育的影响。实际上，在此发育阶段的稚鱼一般以摄食活饵、水蚤或水丝蚓为主。投喂可以满足营养需求的人工饲料以替代活饵，并降低生产成本。由于缺乏有关早期营养需求研究的资料，故尚无法解释这一阶段的人工饲料的技术问题。选择以碳水化合物调节饲料脂类含量的平衡配方可以降低替代物质的影响；而且，以往的试验说明非营养性填充物质，如纤维素等，会强烈地降低稚鱼的生长，结果导致营养研究的误差。

3.1 肠道刷状缘膜水解酶

一般鱼类的消化道上皮细胞的发育至少要在孵化后4周完成。这种成熟过程已经在哺乳动物和鱼类中得到证实。肠道消化的发育可以通过刷状缘片段上的细胞内消化酶、亮氨酰丙氨酸肽酶，与刷状缘膜上酶、碱性磷酸酶的比率来反映，从而判断发育阶段的细胞内消化与外消化的程度。而刷状缘膜上酶的活性，主要是γ-GT和AKP，可以反映刷状缘膜的水解能力，间接判断肠道细胞对饲料的分解能力。

肠道与粘膜发育对营养物质非常敏感，高水平的不饱和脂肪酸可以起到促进刺激成熟的作用，而高水平脂类促进了舌齿鲈稚鱼肠道的发育，并且是mRNA转录水平的变化。本试验处理中，脂类水平高于15%的饲料，刷状缘膜上酶活性有明显提高。而适宜的脂类水平（25%）、肠道γ-GT和AKP都有显著升高，可能起到了促进消化道成熟的作用，这种现象可能也是由于刷状缘膜水解酶活性有了较高的表达。而试验中不饱和脂肪酸的变化主要来自于大豆油，其中含有的不饱和脂肪酸多是短链的不饱和脂肪酸，长链脂肪酸含量很少。这种水解酶活性升高的情况是由于脂肪含量，还是不饱和脂肪酸含量作用的结果尚不清楚。细胞内消化是否受到影响也有待于研究。而且，饲料中不饱和脂肪酸与磷脂的适宜添加量能否起到类似作用也是未来研究的课题。

3.2 增重与成活率

本试验中投喂人工饲料可以产生良好的增重效果。终体重最低的是L1处理。饲料脂类含量由15%升高到30%，终体重最大可以相差15%以上。经30 d的试验，最大增重可达1倍以上，说明鱼体生长需要较高的能量。但这种生长是否造成鱼体脂类的过渡增加，而影响到蛋白质积累尚有待分析。

同样，饲料脂类水平也影响到了成活率，过低或过高的脂类成活率均较低。成活率最高的是L3处理，接近于生物饵料培养的情况。虽然在生长上的差异并不显著，但成活率上却出现了较大差异。在有些处理中，如L1和L2个别个体体重达到500 mg，这种情况说明，相当多的个体生长可能是处于不良的生理状态，即出现大小规格不齐。结果表明，饲料中适宜的脂类含量可能是在20%～25%之间，略高于虹鳟的需求量，低于大西洋鲑的添加量。

4 结论

①当蛋白质含量为48%时，细鳞鱼稚鱼的脂类需求量在20%～30%之间。

②适宜的饲料脂类水平可以增强稚鱼刷状缘膜水解酶活性，而过高的脂类水平会产生抑制作用。饲料脂类水平影响到了肠道上皮细胞的成熟，适宜的脂类水平可以促进肠道成熟以及对饲料成分的利用能力。

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