雌二醇可降解涂层支架置入后对犬冠状动脉内膜增生的影响

宋春莉,张基昌,李杨雪,刘 斌,崔晓倩,李智博,史永峰

（吉林大学第二医院,吉林 长春 130041）

冠状动脉支架置入术后再狭窄一直是冠心病介入治疗研究中的重中之重,其中以冠脉内支架涂层的研究尤为突出。目前应用的药物涂层支架如雷帕霉素与紫杉醇涂层支架,在阻止平滑肌细胞增生的同时也阻止血管内皮细胞增生,使支架被内皮细胞覆盖时间过长或难以被覆盖,容易形成血栓[1,2]。通过加速内皮化已被证实可降低再狭窄及支架内血栓形成,是最具前景的研究方向[3]。雌激素具有复杂多样的生理作用,体外研究已证实雌激素能够抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移,而作用于内皮细胞时则可促进其增殖和迁移[8]。根据此特点,本研究通过构建载雌激素可降解涂层支架,期望加速受损内膜修复的途径来实现消除再狭窄,动物实验评价其安全性及有效性,为新型血管支架的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 杂种犬15条（由吉林大学动物实验中心提供）,重20-25 kg。随机分为3组,雌二醇涂层支架组,聚乳酸（PLA）涂层支架组,裸支架组,每组5只。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 316L不锈钢裸支架（购自乐普医疗器械股份有限公司）;聚乳酸（中国科学院长春应用化学研究所提供）;氯吡格雷（波立维,赛诺非公司）;HE染色剂;17-β雌二醇（购自sigma公司）;枸橡酸钠;甲醛等。

1.2.2 实验步骤 采用共混的方法制备雌二醇涂层支架。术前1日给予阿司匹林100 mg,氯吡格雷75mg,术晨禁食。动物麻醉采用速眠新,肌肉注射0.1 ml/kg,术中适当追加,总量＜0.2 ml/kg。支架用手捏方法捆绑于球囊上,行冠状动脉造影,随机选择左前降支、左回旋支和右冠状动脉的合适血管段,定量冠状动脉造影（QCA）测定其直径,根据参考血管直径,用带支架球囊以球囊/血管1.3∶1的比例,用10-15大气压、15 s单次过度扩张血管形成冠状动脉损伤模型并置入裸支架或PLA涂层支架或雌二醇涂层支架,术后常规复查冠状动脉造影示血管通畅。术后撤出动脉鞘,穿刺点缝合,逐层缝合皮肤,送回动物房喂养。术后予以青霉素300万单位,继续给予口服氯吡格雷37.5mg/d,拜阿司匹林100 mg/d,饲养到4周。

1.3 组织标本制备 支架置入术后4周对实验犬实施处死.立刻分离靶血管,至少1 cm,包括支架置入部位的远端及近端,10%甲醛溶液加压灌注固定24小时,固定后环氧树脂包埋切片,4-5μm厚切片,HE染色及弹力染色。

1.4 病理形态学分析 由计算机图像系统分别测定内膜增生面积、管腔横断面积。内膜增生面积为原始管腔和狭窄管腔面积之差（原始管腔面积-狭窄管腔面积）,面积狭窄百分比由下列公式计算:面积狭窄百分比=100×[1-（狭窄管腔面积÷原始管腔面积）]。

2 结果

2.1 一般情况 所有动物支架均成功置入并存活至实验终点。

2.2 涂层支架一般性状 光学显微镜观察涂层支架扩展时的顺应性,支架直径达到4mm时,涂层无明显裂开、剥脱现象。

2.3 组织学检测结果 造影结果显示即刻植入后的支架血管比率、平均血管直径,三组比较无明显差别。支架置入4周后的状况（表1及图1）:三组管腔面积,雌二醇支架组最大,PLA组及裸支架组无明显差异。雌二醇支架组内膜增生面积较裸支架组及PLA涂层支架组减低（P＜0.05）,PLA涂层支架组和裸支架组无明显差别（P均＞0.05）。说明雌二醇支架加速内膜修复,可减少内膜过度增生。

表1 支架置入4 w后各组组织学检测结果（±s）组别 例数 内膜增生面积（IA） 管腔总面积（TA） 面积狭窄百分比（%）雌二醇支架组 5 0.37±0.16* 4.91±0.38* 7.2±1.6*PLA涂层支架组 5 1.41±0.31# 3.90±0.43# 26.2±2.0#裸支架组 5 1.36±0.25# 3.98±0.61# 25.2±3.4#注:与PLA涂层支架组和裸支架组相比:*＜0.05;PLA涂层支架组与裸支架相比:#＞0.05

图1 4 w后冠状动脉横断面（HE染色,10×）

3 讨论

冠状动脉支架置入术后再狭窄一直是冠心病介入治疗研究热点。目前应用的药物涂层支架如雷帕霉素与紫杉醇涂层支架,大大减少了再狭窄的发生率,但目前仍有5%左右再狭窄发生[3]。雷帕霉素与紫杉醇都是非平滑肌细胞选择性药物,在阻止平滑肌细胞增生的同时也阻止血管内皮细胞增生,使支架被内皮细胞覆盖时间过长或难以被覆盖,容易形成血栓。此外,在支架置入动脉部分可观察到不同程度的慢性炎症从而刺激内膜增生导致再狭窄[4]。2006年欧洲心血管年会引起会议巨大震动和关注的内容是关于药物洗脱支架安全性的临床试验荟萃分析。长期随访结果表明,与金属裸支架比较,药物涂层支架置入后远期血栓形成的风险比金属裸支架增加了15%-35%,不但没有降低总死亡率和心肌梗死的预后硬终点,反而有增加这些预后终点的趋势[3-5]。相关检查发现,其远期血栓发生率增高的主要原因为支架表面内皮化不完全,部分支架裸露在血液中,而患者停用抗血小板药物,使支架内血栓发生率明显增高[4]。故由于存在上述缺点,导致冠脉内支架置入术后患者服用双重或三重抗血小板药物时间增长,从而增加了患者的医疗费用,增加了患者长期双重抗血小板治疗出血风险。而且长期内皮修复不完全,会刺激内膜增生导致再狭窄。故由于存在上述缺点,如何加速受损内膜修复的途径来实现防治再狭窄这一目的,是一崭新且极具前景的研究方向。

随着基础医学研究的深入,目前普遍认为内皮损伤引起的瀑布反应是再狭窄的始动因素[6,7]。因此在抑制平滑肌增殖的同时,加速内皮损伤的修复更重要。同时加速内皮修复受损内膜可降低支架暴露于血液中时间,降低支架置入术后远期血栓发生率,减少患者长期多重抗血小板治疗的时间。最近的研究报道更新了我们对血管新生内膜形成的理解,血管新生内膜不仅可以从血管壁形成还可以由血液循环中前体细胞群形成,例如内皮前体细胞[7]。

内皮化的速度是影响内膜增生程度的一个重要因素。雌激素体外研究已证实雌激素能够抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移,而作用于内皮细胞时则可促进其增殖和迁移[8,15]。研究证实雌激素可促进兔髂动脉球囊损伤后内皮细胞增殖,加快内皮修复并提高损伤内皮功能[11]。Krasinski[9]等的实验发现雌激素能促进大鼠颈动脉球囊损伤区的再内皮化和内皮细胞功能的恢复。Strehlow[10]等发现雌激素能够提高小鼠骨髓及外周血中内皮祖细胞数量,促进内皮祖细胞在损伤动脉处着床、生长,从而促使损伤血管内皮化。机械损伤是导致PCI术后血管平滑肌细胞大量增殖、迁移及分泌细胞外基质的主要原因。据报道血管损伤早期,雌激素能促进血管内皮细胞释放NO、加速损伤血管的再内皮化;同时,雌激素还可抑制损伤局部的炎症反应及损伤后血管平滑肌细胞丝裂素活化蛋白激酶的激活,通过这些途径起到抑制新生内膜形成的作用[11-13]。上述研究初步证实17β-雌二醇洗脱支架安全、有效,具有良好的潜在临床应用前景。

前期New[14]等采用磷酸胆碱包被支架携带17β雌二醇植入猪冠状动脉,4周时17β雌二醇洗脱支架组较裸金属支架组降低了40%的内膜增生。与new实验结果相似,我们利用可降解高分子PLA作为载体,构建了生物可降解雌二醇洗脱支架,实验中雌二醇支架组内膜增生面积比较裸支架组及PLA支架组减低,而裸支架组与PLA支架组无显著差异,说明聚乳酸作为可降解载体具有良好的生物相容性,并没有增加内膜增生,同时具有可降解功能,提高了支架的安全性。因为通过正常的机体代谢途径,经过一定的时间,聚合物最终降解成小分子物质排出体外,没有残留,消除了潜在的聚合物对血管的不良反应可满足支架载体要求。说明生物可降解高分子载雌二醇洗脱支架可通过加速内皮化,可减少内膜过度增生,防止再狭窄,为将来解决支架内再狭窄提供新的理念和方法。

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