创伤性脑损伤后大鼠脑创伤区皮层细胞早期凋亡的实验研究1）

段虎斌，郝春艳，郝解贺，范益民，刘跃亭，仝海波，刘瑞媛

在全身各部位创伤中，创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的致死和致残率居于首位［1］，它是神经外科的常见病之一，随着我国交通、建筑和工矿企业的快速发展，其发病率呈逐年上升趋势。TBI的发生发展机制至今尚未完全明确，有多种学说［2］。本研究旨在分析TBI后大鼠脑创伤区皮层细胞早期凋亡的规律，进一步探究TBI的发生发展机制。为TBI的干预治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 BD FACSCaliburTM全自动多色分析流式细胞仪系统，CellQuestTM获取数据软件，ModFit LTTM分析数据软件（美国BD公司），ZH－蓝星B脑立体定位仪（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司），牙科台式电钻（宁波医疗器械厂），碘化丙啶（Propidum lodide，PI，美国Sigma公司）。

1.2 动物分组 实验选取健康成年雄性Wistar大鼠48只，体重270g～290g，由山西医科大学实验动物中心提供。随机分为3组，即轻度组、中度组、重度组，每组16只。

1.3 实验步骤

1.3.1 造模取脑 乌拉坦腹腔注射（1.2mg/kg）麻醉满意后，将大鼠固定在脑立体定位仪上。用Feeney法按自由落体致伤原理，制成一撞击装置（由军事医学科学院仪器厂加工），撞杆头端直径4.5mm，高2.5mm，外周导管高为40cm，保持90°垂直，每隔1cm有一气孔，以防锤下落时导管内空气压缩阻力的影响。制作TBI模型时沿正中线切开头皮并剥离骨膜，切口长2cm，暴露右顶骨，牙科台式电钻于冠状缝后1.5mm，中线右旁2.5mm处钻一直径为5mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完整，将撞杆头端置骨窗处，击锤（重20g）沿外周导管分别从10cm、30 cm高处自由落下冲击撞杆，造成右顶叶轻、中度脑挫伤。另用击锤（重40g）沿外周导管从25cm高处自由落下冲击撞杆，造成右顶叶重度脑挫伤，致伤冲击力分别为0.028N·s、0.048N·s和0.088N·s，硬膜保持完整，骨蜡封闭骨窗，于伤后1h断头开颅取脑。

1.3.2 收集细胞 PBS液中剥除硬脑膜、蛛网膜、髓质，留取创伤周边区皮质，剪碎，吸管吹打，滤网过滤，滤液离心2次，1 500/min，5min，倒掉上清，留取管底细胞作为待测细胞，调整待测细胞的浓度为0.5×105/mL～1×106/mL。

1.3.3 固定染色 1 000r/min离心5min，弃去培养液，3mL PBS洗涤1次，离心去PBS，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定过夜。离心弃去固定液，3mL PBS重悬5min，400目的筛网过滤1次，1 000r/min离心5min，弃去PBS，用1mL碘化丙啶（PI）染液染色，4℃避光30min。

1.3.4 流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）检测 CellQuestTM软件获取数据，Modifit软件分析凋亡率、DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

1.3.5 结果判断 在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。

2 结 果

PI单染色法检测凋亡细胞DNA亚二倍体含量分析结果显示，轻度组、中度组和重度TBI组的创伤区皮层细胞亚二倍体比 率分别为（8.98±1.29）%、（16.13±1.28）%和（20.11±1.40）%，三组亚二倍体比率差异有统计学意义（P＜0.01），且损伤程度越重亚二倍体比率越高，即早期凋亡现象越严重。

3 讨 论

TBI的发生发展机制尚未完全明确，有许多学说，如血脑屏障学说、钙超载学说、自由基学说、脑微循环学说、能量代谢学说［3－7］等，TBI的原发性脑损伤包括脑震荡、脑挫裂伤和原发性脑干损伤，损伤的病理学改变形式有脑细胞的变性坏死和凋亡，二者可引起继发性脑损伤和神经功能障碍。

细胞凋亡（Apoptosis），又称程序性细胞死亡（programmeddeach，PCD），是细胞在体内外多种因素刺激诱导下，启动了死亡程序，并有多种基因调控的主动死亡过程［8］。细胞凋亡的检测方法较多，包括光镜与电镜的形态学观察、琼脂糖凝胶电泳法检测DNA梯形条带法、TUNEL法等［9］。

目前对TBI的细胞凋亡分子生物学研究已深入到基因水平，基因改变在脑损伤后皮层细胞凋亡机制及神经修复中有重要意义。皮质直接打击伤（cortical impact injury，CII）可改变cfos、c－jun等即刻早期基因（IEGs）的表达，c－fos基因是促细胞凋亡基因，原位杂交实验发现伤侧大脑皮层c－fos mRNA表达增加，峰值在伤后1h，1d后正常［10］。本实验采用流式细胞仪PI染色法检测创伤区脑细胞亚二倍体核形峰的特征。其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。已有实验证明凋亡细胞在固定和清洗时，降解的小分子DNA外漏，导致细胞内DNA含量减少，因此，应用特异荧光染料PI染色后，在FCM进行的细胞周期分析中，凋亡细胞常常以亚二倍体形式出现，该亚二倍体细胞群被称为亚G1期（sub－G1）细胞，它的出现被认为是细胞凋亡的重要标志［11］。

本研究发现脑损伤细胞早期凋亡存在规律性，即损伤程度愈重，创伤区皮层细胞亚二倍体比率越高，即早期凋亡现象越明显，这与临床上重型颅脑损伤患者表现出来的脑神经功能障碍也最严重相一致。

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