杜仲叶提取物清除DPPH自由基作用的研究

董文宾， 许先猛

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 前 言

现代药理研究表明[1]，杜仲含许多药用有效成分，如生物碱、黄酮类、微量元素、维生素、氨基酸等，具有消炎抑菌、抗疲劳、降血压、抗衰老、抗癌、增强免疫功能等诸多功效，而且杜仲作为保健食品原料已获得国家批准.目前，杜仲及杜仲叶中的各功效已经被国内外学者广泛研究，但是在其抗氧化、清除自由基方面的研究很少有报道.本研究测定了杜仲叶不同有机溶剂提取物对DPPH·的清除能力，对60%乙醇提取物进行了初步大孔树脂分离纯化，并且测定了初分离物对DPPH·的清除率，为杜仲叶在抗氧化、清除自由基的研究方面提供了一定的理论依据.

1 实验材料与方法

1.1 材料与仪器

原料：杜仲叶(采自陕西略阳)，阴干，粉碎过60目筛.

试剂：1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基，Sigma公司；95%乙醇，分析纯，天津市红岩化学试剂厂；丙酮、乙酸乙酯，分析纯，利安隆博华医药化学有限公司；甲醇，分析纯，天津市百世化工有限公司.

仪器：754PC型紫外可见分光光度计、722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；BS-224型电子天平，德国SARTORIUS公司；微量移液器，芬兰Dragonmed 公司；RE-52AA型旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ循环水多用真空泵，上海亚荣生化仪器厂；HYG摇瓶柜，上海欣蕊自动化设备有限公司[2].

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

杜仲叶阴干→粉碎过筛→称取→震荡提取→过滤、离心→浓缩→干燥→测定

└→上柱→乙醇洗脱→浓缩→干燥→测定

1.2.2 操作要点

(1)原料选择：杜仲叶粉碎，过60目筛.

(2)震荡提取：震荡提取条件为30 ℃，50 r/min，提取12 h.

(3)离心：3 500 r/min，15 min.

(4)浓缩：浓缩过程中温度不超过50 ℃.

(5)上柱：树脂预处理[3]：选用树脂XDA-8，取适量(30 g)用1 mol/L的NaOH溶液浸泡4 h，用纯净水洗至中性，然后用1 mol/L的HCl浸泡24 h，用纯净水冲洗至中性，用70%乙醇浸泡24 h备用.上样：预处理后树脂装柱后用蒸馏水冲洗至无白色混浊、无醇味为止.将60%乙醇提取浓缩液缓缓加入柱中，恒速(10 mL/min)流出，至流出液与加入液颜色相同为止，多加1/2树脂体积的样液，静置吸附24 h.

(6)洗脱：蒸馏水洗至基本无色→30%乙醇洗脱(500 mL)→60%乙醇洗脱(500 mL)→90%乙醇洗脱(500 mL).

(7)测定：操作迅速准确，尽量保证各待测管反应同时进行，确保时间间隔在5 s内.

1.2.3 DPPH·清除率的测定[4]

在试管中加入4.0 mL 51.54 mg/mL DPPH 乙醇溶液和1.0 mL无水乙醇，混匀，反应30 min后在517 nm处测吸光值，记为A0；加入4.0 mL 51.54 mg/mL DPPH 乙醇溶液和1.0 mL待测液，混匀，反应30 min后测吸光值，记为A1；加入4.0 mL 无水乙醇和1.0 mL待测液，混匀，反应30 min后测吸光值，记为A2.按照下列公式计算自由基清除率.

清除率=1-(A1-A2)/A0

2 结果与讨论

2.1 杜仲叶不同溶剂提取物对DPPH·的清除作用

杜仲叶不同溶剂提取物对DPPH·的清除作用有所差别，为了评价不同溶剂提取物的抗氧化性能和自由基清除能力，本试验选择清除率为50%时不同溶剂提取物的质量浓度(EC50)作为评价指标，EC50值越小，提取物清除自由基能力越强.杜仲叶不同溶剂提取物清除率与其质量浓度之间的关系如图1所示.

根据提取物清除率与抗氧化剂质量浓度之间的线性关系，计算出杜仲叶不同溶剂提取物的EC50，结果如表1所示.

图1 不同溶剂提取物的清除率曲线

表1 杜仲叶不同溶剂提取物的EC50

由表1可知：不同溶剂提取得到的杜仲叶提取物对DPPH·均有清除作用，其清除能力大小顺序为95%乙醇提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>丙酮提取物.随着样品浓度增加，95%乙醇与甲醇提取物对DPPH·的清除率趋于平衡；乙酸乙酯与丙酮提取物对DPPH·的清除率可达98%.综合考虑溶剂安全性及抗氧化能力，本试验对杜仲叶乙醇提取物清除DPPH·的作用进行进一步研究.

2.2 杜仲叶不同浓度乙醇提取物对DPPH·的清除作用

研究表明[4,5]，用DPPH·法测定不同提取物的清除率，30 min左右反应达到平衡.本试验考察了0.33 mg/mL的30%、60%、95%乙醇提取物30 min内时间与提取物对DPPH·清除率之间的关系，每隔2 min测定样品并计算清除率，结果如图2所示.

图2 不同浓度乙醇提取物反应时间与清除率的关系曲线 图3 树脂吸附后不同浓度乙醇洗脱物反应时间与清除率的关系曲线

由图2可知：不同浓度乙醇的杜仲叶提取物对DPPH·清除率大小顺序为60%>95% >30%(乙醇提取物)，所以杜仲叶60%乙醇提取物抗氧化效果较好，本试验继续对杜仲叶60%乙醇提取物清除DPPH·的作用进行研究.

2.3 大孔树脂分离纯化组分对DPPH·的清除作用

用60%乙醇溶液提取杜仲叶，提取液经浓缩后上柱、吸附，采用不同浓度乙醇进行洗脱，对洗脱液进行浓缩、干燥.配制0.33 mg/mL的30%、60%、90%乙醇洗脱物，测定各洗脱组分30 min内时间与洗脱物对DPPH·清除率之间的关系，结果如图3所示.

由图3可知：60%乙醇提取物经大孔树脂吸附后，不同浓度乙醇洗脱组分对DPPH·都有一定的清除作用，其清除率大小顺序为60% >90% >30%(乙醇洗脱物).

3 结 论

(1)4种不同溶剂杜仲叶提取物对DPPH·清除作用大小顺序为：95%乙醇提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>丙酮提取物.提取物浓度与对DPPH·的清除率呈现非线性关系，随着浓度的增加，各提取物对DPPH·的清除率增加速度不同.

(2)不同浓度乙醇的杜仲叶提取物对DPPH·的清除率大小顺序为60% >95% >30%(乙醇提取物).

(3)60%乙醇提取物经大孔树脂吸附后，不同浓度乙醇洗脱组分清除率大小顺序为60% >90% >30%(乙醇洗脱物).

(4)经大孔树脂初步分离纯化后的组分比粗提物组分对DPPH·的清除率大.

(5)杜仲叶提取抗氧化组分在加热条件下和空气中都有较好的稳定性.

参考文献

[1] 邓素兰,余继宏,管 林,等.杜仲不同部位总黄酮含量的测定[J].生物质化学工程,2007,41(3)：37-38.

[2] 李娇娟,黄克瀛,龚建良,等.油茶叶乙醇提取物清除DPPH自由基作用的研究[J].林产化学与工业,2008,28(2)：81-86.

[3] 刘军海,裘爱泳.大孔吸附树脂提取纯化杜仲叶绿原酸的研究[J].山东医药,2004,44(23)：1-3.

[4] 彭 琼,陈丛瑾.桑叶不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除作用[J].光谱实验室,2008,25(3)：307-309.

[5] 李 红,张元湖.应用DPPH·法测定苹果提取物的抗氧化能力[J].山东农业大学学报,2004,36(1)：35-38.