王丽 阙冬梅 胡永轩 黄晓 张军民
(中山大学孙逸仙纪念医院皮肤性病科,广州 510120)
着色芽生菌病 (Chromoblastomycosis,CBM)是一种慢性肉芽肿性真菌病,常见的病原菌是一组暗色孢科真菌,该病原菌在体外环境,如植物、土壤中,往往以菌丝、分生孢子存在。通过外伤接触植入体内,在表皮微脓肿和多核巨细胞内形成深棕色、厚壁、圆形、卵圆形或不规则形中央有横隔的孢子,即特征性的硬壳小体,并在慢性经过中形成皮肤结节、斑块、疣状增殖、疤痕、脓疱等多种损害。
CBM发生于世界各地,但多流行于热带或亚热带地区,以农业或林业劳动者多见。该病顽固难治、复发率高,通常局限于皮肤和皮下组织,晚期可经淋巴管血管播散,脑组织及其他脏器受损,致畸致残,甚至在慢性溃疡的基础上发生鳞状细胞癌[1]。该病的诊断依据为皮损直接镜检或病理切片发现硬壳小体及培养有暗色孢科真菌生长、以及病原菌分子生物学鉴定[2]。
深入研究着色芽生菌病的发病机制一直是该领域的研究热点,本文主要从微生物学、免疫学、分子生物学对着色芽生菌病的致病机制进行综述。
着色芽生菌病的病原菌为一组暗色孢科真菌,主要包括着色霉菌属 (裴氏着色霉、紧密着色霉、Fonsecaea monophora)、枝孢霉属 (卡氏枝孢霉、播水喙枝孢)及疣状瓶霉,其中裴氏着色霉、卡氏枝孢霉最常见[3]。在世界范围内,CBM的主要致病菌是裴氏着色霉,非洲、澳大利亚及马达加斯加地区的主要致病菌是卡氏枝孢霉[4],我国北方主要致病菌是卡氏枝孢霉,而华南地区则以裴氏着色霉为主[5]。这些病原菌的共同特征是细胞壁产黑色素,均以暗色菌落为特征,但有枝孢型、瓶霉型、喙枝孢型等不同产孢方式,是形态学鉴定的主要依据[6]。近年来基于rDNA内转录间隔区(ITS)序列分析在着色真菌分类中起到重要作用[7]。席丽艳等通过分析多株裴氏着色霉的ITS序列,发现Fonsecaea monophora是中国南方地区着色芽生菌病的最主要致病菌,不同于以往传统观念的“裴氏着色霉是中国南方地区主要致病菌”[5]。
对着色真菌微生物组分的研究主要集中在以下几个方面。
黑色素使真菌具有较强的抵御外来离子辐射、温度变化、pH值改变的能力,也是引发真菌耐药性形成的重要因素[8]。主要包括细胞壁和细胞外可溶性黑色素。着色真菌细胞壁上的黑色素是着色真菌的重要毒力因子。Cunha等[9]发现,裴氏着色霉细胞壁上的黑色素能抵御H2O2及NO的氧化杀伤作用。通过比较色素组、TC(三环唑)色素抑制组与巨噬细胞共培养后NO浓度,NBT染料检测细胞壁氧化颗粒,证实了色素组明显下调了巨噬细胞NO的释放,抑制了巨噬细胞对裴氏着色霉的氧化杀伤作用。此外Nobreqa等[10]发现裴氏着色霉细胞壁上含有黑色素的F2片段可下调Th1细胞因子,上调Th2细胞因子,有利于菌体的侵袭作用。不同于细胞壁上黑色素毒力作用,Alviano等[11]发现,裴氏着色霉细胞外可溶性色素具有刺激机体产生免疫保护性作用。可溶性色素能与相应血清抗体发生反应;在有色素存在的感染灶中,特异性免疫反应异常活跃。此外,可溶性色素增强了中性粒细胞、巨噬细胞对菌体的吞噬能力及氧化杀伤效应。具有极强的抗真菌感染效应。
唾液酸是裴氏着色霉分生孢子和菌丝体细胞表面成分,在细胞的形态发生和细胞的完整性维持方面具有重要的作用[12]。病原菌表达的唾液酸可以保护其抵抗宿主免疫细胞的吞噬作用而逃避杀伤,从而在体内顺利转变成寄生态的硬壳小体。着色真菌分生孢子经唾液酸酶处理后被健康个体的中性粒细胞的吞噬增多[13]。
着色真菌的胞外酶包括:磷脂酶、ATP酶、蛋白酶等,在着色真菌生长周期不同阶段 (菌丝体、分生孢子、硬壳小体)各种酶的表达量也不同。为了适应体内环境,相对于分生孢子和菌丝体,硬壳小体具有较高的酶活性[14]。胞外磷酸酶有助于裴氏着色霉的分生孢子黏附于宿主细胞[15]。裴氏着色霉的分生孢子分泌的天冬氨酸蛋白酶,能够水解人重要的血清蛋白如白蛋白、纤维素及血红蛋白。通过抑制天冬氨酸蛋白酶,可抑制分生孢子的生长,抑制其向菌丝体的转化[16]。
在着色真菌的毒力与机体免疫系统相互作用过程中,中性粒细胞和巨噬细胞发挥着重要作用[17]。巨噬细胞一般不能直接杀灭菌体,但可通过氧化应激,释放NO对菌体生长起抑制作用[18]。中性粒细胞在与菌体作用20 min内即可将其杀灭,主要通过细胞外细胞毒性物质、髓过氧化物酶的释放引发氧化杀伤[19]。巨噬细胞在CBM中发挥的作用因致病菌不同而异,其对裴氏着色霉和播水喙枝孢霉的吞噬指数高于其他致病菌。补体介导的吞噬对疣状瓶霉和播水喙枝孢霉尤为重要,但当巨噬细胞吞噬了裴氏着色霉或播水喙枝孢霉后,此效应可被甘露聚糖所抑制。巨噬细胞发生吞噬后,MHC-II类分子和CD80表达下调,基础NO释放受抑制,但吞噬播水喙枝孢霉则不发生该效应,提示巨噬细胞只对播水喙枝孢霉具有显著杀伤效应[20]。
皮肤巨噬细胞内有来自裴氏着色霉的抗原,同样的现象在树突状细胞和郞罕氏细胞中也被观察到[21-22],提示这些细胞在抗着色真菌免疫中起着抗原提呈作用。Da Silva等[23]研究了BALB/c小鼠皮肤来源的朗格汉斯细胞与裴氏着色霉孢子或硬壳细胞之间的相互作用,发现在共同培养时,郞罕氏细胞在最初3 h内可吞噬孢子,但不吞噬硬壳小体,在12 h内菌丝的形成受到抑制。孢子可通过抑制郞罕氏细胞中的CD40和B7-2的表达进而抑制郞罕氏细胞的成熟,而硬壳小体则不具此作用。
此外着色芽生菌病的严重程度与机体内Th1、Th2免疫反应的平衡程度有密切关系,菌体的生长与增殖依赖于抑制Th1、加强Th2免疫反应。研究显示严重难治型的CBM患者,可检测到高水平的IL-10,低水平的IFN-γ,并显示T细胞增生不良;反之,若患者病情较轻,则产生高水平的IFN-γ,低水平的IL-10,并可见有效的T细胞增生,提示细胞免疫在疾病过程中起重要作用[24-25]。此外CD4+T细胞是杀伤着色真菌的主要免疫细胞。Teixeira等[26]以裴氏着色霉孢子注射小鼠,与野生型小鼠相比,CD4+T细胞缺陷小鼠肝脾中真菌计数更高,而CD8+T缺陷小鼠则无明显差别。同时前者IFN-γ产量明显减低,而后者则无明显差别。
Sá等[27]用免疫组化方法,检测CMB患者与正常人群的细胞亚群、趋化因子、趋化因子受体、酶的表达差异性。结果显示患者所有指标 (CD68、S100、CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD20、CD56、CD15、MIP-1α、CXCR3、CCR1、SOD、i-NOS)均增高。CD15+和 CD56+细胞少于 CD3+,CD4+,CD20+和CD68+细胞。载菌量与CD3+,CD45RO+和iNOS+细胞数呈正相关。MIP-1α表达与CD45RO、CD68、iNOS、CXCR3 相关,提示 MIP-1α在感染灶炎症细胞的招募中起到重要作用。
迄今为止,关于着色真菌致病机制方面的分子生物学研究较为缺乏。目前主要侧重于基因遗传学,菌体形态转换机制等方面的研究。在基因遗传学方面,研究表明欧洲、亚洲、拉丁美洲、非洲人群CBM发病率无明显差异,但CBM患者HLA-A29阳性的几率约为其他人群的7倍,提示CBM易感性与6号染色体上的HLA基因相关,HLA-A29阳性者患CBM的相对危险度为10[28]。在形态转换机制方面,着色真菌有3种形态:繁殖结构分生孢子、腐生结构菌丝体、寄生状态硬壳小体。国内外学者认为,硬壳小体是着色真菌为了适应宿主体内的环境而发生的形态改变。Cdc42基因在Fonsecaea monophora硬壳小体的表达量明显高于菌丝、分生孢子,提示Cdc42基因可能参与硬壳小体形成的调节[29]。
CBM患病率具有明显的性别差异,常见于男性,男女患病率之比从5∶1至9∶1不等。部分学者认为雌激素可能干扰了着色真菌从菌丝相转化为酵母相,从而降低其致病性。Hernández-Hernández等[30]研究显示孕酮和睾酮对体外生长的裴式着色霉、卡氏枝孢霉、疣状瓶霉均有抑制作用,并在疣状瓶霉的胞质中发现黄体酮受体。另外,患有免疫缺陷性疾病或因接受大量皮质类固醇激素治疗而导致免疫功能抑制者,患CBM的几率增高,CBM与恶性疾病的密切相关性亦越来越受到重视[31]。
着色芽生菌病发展缓慢,易复发,危害大,并可诱发鳞状细胞癌。其致病机制正在逐步得到阐明,但相关研究仍然匮乏。我们需要加强对着色真菌微生物学、免疫学的研究及认识,进一步拓展分子生物学领域,从基因、蛋白水平探究其发病机理,为更好地指导临床工作奠定坚实的理论基础。
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