陈华民, 何晨阳
(中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)
RNAi基因沉默 (RNA interference-mediated gene silencing)是由双链RNA(ds RNA)产生的小RNA(s RNAs)(si RNA、ta-si RNA、ra-si RNAs、natsi RNA和mi RNA)引起的[1],其共同过程是作为RNAi激发子的ds RNA被Dicer酶识别后、切割成21~25个核苷酸的小干扰RNA(si RNA)片段;si RNA与靶基因mRNA的相应序列在RNA诱导基因沉默复合体(RISC)上进行结合,然后这些短的ds RNAs中的反义链特异性地识别互补mRNA的靶序列,从而在其中间部位进行切割或翻译抑制,从而实现对靶基因转录后或翻译后调控。植物细胞质、核中均可发生RNAi基因沉默[2]。
RNAi基因沉默机制主要包括:(1)s RNAs通过与靶标序列结合,在识别的特异位点对序列进行剪切,形成转录后的基因沉默[3];(2)s RNAs通过与靶标序列结合,造成蛋白翻译起始障碍,形成蛋白质翻译的沉默[4];(3)通过将与s RNA 同源的 DNA 区域中的胞嘧啶甲基化,形成了s RNA介导的DNA甲基化(Rd DM),即表观遗传效应[5-7]。植物 RNAi基因沉默通常是通过剪切靶标mRNA,使其不能作为蛋白质翻译的模板,从而抑制基因的表达。
由于靶基因表达需要受到精确的调控,RNAi基因沉默也需要进行时空调控。植物体内RNAi基因沉默/抑制通常是系统发生的[8-10],但在实际需要中仅沉默部分组织中特定基因,这会引起其他组织中靶基因表达的抑制。所以有必要研发和利用组织特异性启动子、来调控基因的沉默效果。此外,基因沉默需要在时间和强度上的进行调控。通过筛选不同强度的启动子来控制ds RNA的表达,或利用不同的同源序列来抑制靶基因,可以达到调控抑制程度的目的。
RNAi基因沉默需要ds RNA与靶基因序列结合。如何使ds RNA有效地到达靶序列所在的部位是RNAi技术的关键问题。通过沉默与癌症、病毒侵染和自身免疫紊乱等疾病相关基因的表达,RNAi技术已成为一种有效的疾病治疗新策略。在医学和动物疾病(尤其病毒病)的研究中发现,dsRNAs可以到达癌变特异部位[11-13],而目前在植物中尚未见任何类似的报道。
病毒抑制子可以与sRNA结合抑制后者的基因沉默功能[14]。对抑制子特异结合位点进行修饰,使其不能与s RNA进行正常结合,可以提高后者的沉默效率,如RHBV病毒抑制子NS3[15]。因此,研究和利用病毒抑制子结合位点,可以有效地提高基因沉默效率。
miRNAs通过与反向互补的mRNAs序列结合,在RISC中进行剪切或翻译后抑制。研究证明mi RNAs可能比ds RNAs更为重要。可以适当修饰mi RNA序列、特异性地沉默靶基因,而沉默效果不受影响。
人工设计和合成amiRNAs和ana-siRNAs可以解决RNAi脱靶效应(非靶标基因沉默)。与传统RNAi技术相比,ami RNAs特异性更高,可以更精确地预测对潜在的非特异靶标的影响。传统RNAi技术的siRNAs前体可以形成多个5′-和3′-序列不同的小RNA,而mi RNAs前体只能形成一个特定序列的高效s RNA。因此,ami RNAs技术在更大程度上规避了对相似序列的非靶标基因的影响。此外,ami RNAs基因沉默效果不仅依赖于自身特性,而且依赖于靶标基因mRNAs的局部结构[16]。因此,人工设计和合成amiRNAs时,需要特别考虑靶基因序列的结构。
ta-siRNAs是一类内源的sRNAs,产生于非编码TAS基因介导转录的4个家族,负责转录后的基因调控[17]。ta-siRNAs的形成涉及21nt的siRNAs和miRNAs指导的切割,以miRNAs和siRNAs的序列为模板,聚合形成的次级RNA小片段。尽管ami RNAs载体的可预测性高、不易脱靶,但ata-siRNAs方法更为实用,因为它更易于多个功能小RNAs序列融合进一个载体中,从而可以创建具有多抗功能的转基因植物[18]。
amiRNAs对病毒抑制子的沉默。与hp-RNA产生的沉默效果相比,靶向CMV抑制子2 b的amiRNA方法在瞬时表达、稳定转化方面效果更好[19]。靶向株系特异序列或不同株系间保守序列的转基因植株表现对CMV广谱抗性[19]。拟南芥mi R159通过修饰拟南芥mi R159的前体来靶向两个病 毒 抑 制 子 序 列 (P69、HC-Pr o)。ami RNAP69159和amiRNA-HC-Pro159转基因植株分别具有对TYMV和Tu MV的抗性,而表达两者的植株表达对两个病毒都具有很强的抗性[20]。
ata-siRNAs对报告基因FAD2的沉默。FAD2是拟南芥基因沉默分析的报告基因,单拷贝,表型易检测定量分析[21]。用ata-siRNAs序列沉默FAD2基因,发现转基因植株FAD2活性水平与f ad2突变体一样,达到了基因沉默效果[22]。
RNAi技术已经在病原物(真菌、细菌、病毒和线虫)基因沉默方面得到了广泛应用,产生了一批抗病性增强的转基因植物。
通过表达白粉病菌致病因子Avra10的RNA同源序列,转基因植物表现出对白粉病的抗性[23]。其机制是植物dsRNA分子可能进入了病原真菌体内,从而导致了真菌基因的沉默(HIGS)。这一结果提供了一个基于RNAi的植物抗真菌病害遗传改良新策略。
根癌农杆菌iaa M和ipt基因沉默后,转基因植物对冠瘿瘤形成具有较高的抗性[24]。iaa M编码色氨酸单加氧酶,将色氨酸转变成生长素前体吲哚乙酰胺[25];ipt编码产物促成A MP和异戊烯基焦磷酸盐的浓缩,并形成细胞分裂素(玉米素)[26]。这两个基因的表达是冠瘿瘤形成所必需的。用靶向iaa M和ipt的RNAi载体转化拟南芥和番茄植株,转基因植物肿瘤形成得到明显的抑制。
水稻条纹叶枯病(RSV)CP、SP和CP/SP蛋白、水稻矮缩病毒(RDV)Pns12蛋白、玉米矮花叶病毒(MDMV)CP蛋白、菜豆金黄花叶病毒(BGMV)复制起始因子AC1基因沉默/抑制后,转基因植株对病毒病抗性明显提高[27-29]。
不同编码基因沉默导致的病毒抗性是有明显差异的,靶基因的选择至关重要。例如RSV编码蛋白p C3和运动蛋白p C4沉默转基因植株表现高抗,而编码糖蛋白p C2和无结构蛋白p4的沉默对抗性没有影响[30]。
病毒诱导的基因沉默(VIGS)常受限于病毒的寄主范围。因此,直接喷洒原核表达的si RNAs也可诱导植物基因沉默,如在接种病毒前5 d,喷洒辣椒轻斑驳病毒(PMMo V)和李痘疱病毒(PPV)的ds RNA,可成功诱导相关基因的沉默,产生对病毒侵染的抗性[31]。
表达根结线虫基因ds RNA序列的烟草对根结线虫的抗性高达95%以上[32]。表达线虫16D10基因ds RNA序列的拟南芥抑制了线虫虫瘿的形成、减少了虫卵产生;转基因植株对其他种线虫也具有一定的抗性[33]。
RNAi基因沉默技术因其特异性、高效性和遗传可操作性,已经成为当今植物基因功能研究和作物遗传改良的一个重要手段,正在迅速得到广泛的应用。近年来,随着研发工作的不断深入,该技术得到了极大的提高和完善。例如利用组织特异性和诱导型启动子,将使基因沉默的时空调控能力得以提高,从而使RNAi脱靶效应降至最小[34]。本实验室正在利用从水稻叶片中克隆到的、受病原细菌和信号分子诱导的、维管束组织特异性表达的启动子Os BTF3-p[35],驱动 RNAi基因沉默载体(待发表)。
挖掘更多组织特异性和诱导型启动子,将是加快RNAi技术在作物遗传改良中应用的重要任务之一。ami RNAs和ata-si RNAs的研发也加快了RNAi基因沉默技术的应用[18]。
在与植物互作过程中,病原真菌可能通过吸器、线虫通过口针刺吸、病毒通过RNA或DNA分子进入、根癌农杆菌通过T-DNA整合,与寄主植物细胞进行核酸类物质的分子交流。这些为进行RNAi基因沉默提供了科学基础和依据。然而,至今尚不清楚其他病原细菌与植物间是否存在核酸分子的交流。对此需要进行深入的研究,为植物抗细菌病害改良提出新的思路。
RNAi技术需要不断地改进和完善才能得以充分的利用。需要不断地鉴定和发掘病原物致病因子基因、植物感病因子基因用作RNAi靶标;构建和设计将多个基因定位在一个RNAi载体中,有效地降低病原物变异造成的抗病性丧失的几率,解决作物持久抗病性的改良问题。
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