生物材料的细胞生物相容性评价方法的研究进展

林红赛 王春仁 王志杰 张华

1 中国食品药品检定研究院 （北京 100050）

2 华南理工大学生物医学工程研究院 （广州 510640）

3 苏州大学基础医学院 （苏州 215021）

0.引言

细胞生物相容性评价是生物材料生物相容性评价的一项重要内容，细胞毒性试验作为检测生物材料毒性的手段，具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点，已被广泛应用于生物相容性评价。以往对生物材料的细胞生物相容性的评价往往只着眼于细胞的形态与数量的变化，随后发展到对细胞生长、附着、增殖及代谢方面的影响，并提出了以有活力的细胞数和细胞增殖能力作为评价生物材料细胞生物相容性的观点。20世纪90年代初，有学者提出并确定了对生物材料进行分子水平生物相容性研究的设想，借助分子生物学手段从分子水平研究生物材料对细胞行为的影响，进而阐明生物材料对细胞作用的机制[1]。

细胞毒性试验是生物材料细胞生物相容性评价最常用的方法，细胞毒性评价方法种类繁多，GB/T16886标准中按照材料与细胞的接触方式，分为浸提液法（主要是MTT试验法）、直接接触法、分子滤过法和琼脂覆盖法。另有按照不同的生物学终点即不同评价指标进行分类的方法，如细胞形态学、细胞膜效应、细胞代谢活性、细胞增殖率等评价方法。近几年也不断涌现出新的细胞毒性试验评价方法，如细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖相关蛋白检测等。不同生物材料的细胞毒性机制往往不同，选择多生物学终点评价方法可以初步探讨材料细胞毒性的机制，同时综合运用近几年发展迅速的分子生物学方法可以更进一步明确材料的毒性机理。本文主要就常用的评价指标和评价方法及应用进展作一综述，可为研究者在细胞生物相容性的方法选择上提供参考。

2.传统的多生物学终点细胞毒性评价方法

2.1 细胞形态学评价

一种发展最早的定性细胞损伤检测方法，材料导致细胞损伤从而发生形态学的改变，通过显微镜下观察到变圆或裂解细胞所占的百分比来估算细胞毒性级别。目测细胞毒性试验方无法定量细胞毒性大小，但2008年Sujata[2]等对显微镜下观察细胞形态毒性的定性判定方法与MTT法等定量细胞毒性判定法进行了比较，研究得出Pearson相关系数为0.9，说明二者具有良好的相关性。此外，由于该方法可直观地观察到材料细胞毒性的大小，所以目前仍被广泛用于生物材料细胞毒性的评价。

2.2 细胞膜效应评价

(1) 中性红摄取试验（neutral red uptake，NRU）

检测原理是未受损的细胞可摄取中性红染料并将其蓄积在溶酶体内，用中性红染液洗脱剂（乙醇或乙酸）溶解中性红，并通过酶标仪检测定量中性红，活细胞摄入中性红的水平与活细胞的数量成正比。Borenfreund等[3]根据这一特性建立了中性摄取试验法，并对几种金属材料的细胞毒性进行了评价，认为中性红摄取试验是细胞毒评价的快速评价方法。国际标准ISO 10993-5:2009已收录该检测方法及具体的操作步骤。

(2) 乳酸脱氢酶释放法（LDH释放法）

乳酸脱氢酶（LDH）是一种细胞胞浆内酶，正常时仅存在于细胞内，当细胞受到损伤裂解时即释放到细胞外，所以培养液中该酶活性与被裂解的细胞数量成正比。LDH释放法只需测定培养后上清液的LDH活性，操作简单，客观性好并克服了形态学法的主要缺点。此外，由于LDH是一种糖醇解酶，广泛存在于各种细胞中，这种酶仅在靶细胞变性时释放出胞外，易检测，无标记过程，不存在防护问题，自发释放率也小[5]。Issa等[6]采用MTT法和LDH释放法检测松香复合物（resin composite monomers）释放出的单体的毒性大小，结果表明LDH释放法较MTT法敏感，但二者均呈现了相似的细胞毒性等级。

2.3 细胞代谢活性评价

目前，以线粒体琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法应用最广泛。线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征之一，所以可以十分灵敏地反映出材料对细胞造成的毒性损害程度。

(1) MTT试验

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。该试验过程简便，自动化程度高，无需复杂、昂贵的仪器，已是目前应用最广泛的细胞毒性评价方法之一。但是在测定过程中产生不溶于水的结晶产物，需要用DMSO溶解后才能测定光吸收值，若结晶物溶解不完全，会影响测定结果，所以MTT试验法重复性略差。

(2) XTT试验

在MTT试验法的基础上发展了XTT试验法。XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，为线粒体脱氢酶的作用底物，可被活细胞还原形成水溶性的棕黄色的甲臜产物，与电子耦合剂如硫酸酚嗪甲酯（PMS）共同使用形成甲臜产物，该甲臜属于水溶性产物，其生成量与活细胞数量成正相关。Scudiero等[7]首次采用XTT体外细胞增殖和药敏检测，所得出的细胞生长曲线与MTT法检测结果相似。Roehm等[8]的实验结果显示XTT法产生的甲臜多于MTT法，且实验时间短、步骤简便，认为XTT比色法优于MTT法。XTT已广泛用于生物材料的相容性评价[9,10]。此外，与XTT类似的四唑氮衍生物还有MTS、WST-1，它们经活细胞线粒体脱氢酶转化亦形成水溶性有色物质，可直接进行比色，从而减少了实验操作误差。由于该法较MTT法具有明显的优点，已被纳入国际标准ISO 10993-5:2009中，但实验成本较MTT法高。

2.4 细胞增殖率评价

观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞生长速度和增殖率的改变，主要有克隆形成试验。克隆形成试验是检测与生物材料作用后的细胞的克隆形成能力，用克隆形成率（实验组的克隆数/对照组克隆数）评价材料的细胞毒性，最早由Tuchiya[16]等研究者提出。Kotoura等[12]在1985年用克隆形成试验法对两种金属（钛和镍）、两种陶瓷（氧化铝陶瓷和磷酸钙）及两种聚合物（高密度聚乙烯和聚氯乙烯）进行了细胞毒评价，结果发现克隆形成试验可以用于毒性材料的筛选。Tuchiya等[11]选用分子滤过法、琼脂覆盖法、中性红摄取法和克隆形成试验（包括直接接触法和浸提液法）对两参照样品（ZDEC-PU和ZDBC-PU）的毒性进行了检测，结果发现克隆形成试验（直接接触法）较其他几种方法敏感，并能检测出微弱的细胞毒性。由于该方法的敏感性高，已收录在国际标准ISO 10993-5:2009中。

2.5 DNA合成率检测

通过直接测定进行有丝分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力，主要有5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）渗入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法，3H-TdR渗入法因同位素3H具有放射性污染、操作复杂等缺点，没有得到广泛的应用。5-溴脱氧核苷尿嘧啶为胸腺嘧啶的衍生物，在DNA合成期（S期）可代替胸腺嘧啶而被摄入合成DNA，测定结合了荧光燃料的抗BrdU单克隆抗体得出Brdu的摄入量，通过流式细胞仪或细胞酶联反应测定带有标记DNA的细胞所占比率，可以反映与材料接触后的细胞的增殖能力。Dekker[13]等对MTT法、蛋白质含量检测法及5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）渗入法三种定量检测方法进行比较，结果发现虽然5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）渗入法是最敏感的方法，但重复性略差。

3.细胞毒性评价方法的补充

3.1 细胞周期的检测

近些年通过检测细胞周期来评价生物材料细胞毒性的研究报道日趋增多。细胞周期检测需借助流式细胞仪技术（FCM），其利用鞘流原理，使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列，按重力方向流动。细胞被激光照射后发射荧光，检测器可逐个对细胞的荧光强度进行测定，FCM对细胞测定能力是30万～60万个细胞/分钟，同时可对细胞的核酸、蛋白质、酶、细胞周期分布等多种参数进行测定。该技术在材料的生物相容性评价中已有着广泛的应用价值。1998年，MA[14]等用流式细胞仪技术评价羟基磷灰石（HA）复合材料的生物相容性，发现细胞形态学观察法未观察到细胞毒性，但FCM分析得出HA的组成成分会影响细胞周期。戴建国[25]等人用流式细胞仪检测羟基磷灰石浸提液对L929细胞生长周期及凋亡的影响，进而评价其生物相容性，并期望探讨将细胞周期检测作为生物材料细胞生物相容性的重要补充。Reza等[16]提出FCM可以作为牙科材料理想且实用的细胞毒性评价方法。Zhang等[17]采用了MTT法、FCM和RT-PCR三种方法对五种口腔修复材料进行了细胞毒评价，结果显示FCM和RTPCR两种方法更加敏感，并建议作为传统细胞毒评价方法的重要补充。

3.2 细胞增殖相关蛋白检测

Ki-67是一种与细胞周期相关的增殖细胞核抗原，Ki-67表达于所有的增殖细胞的细胞核内，是检测细胞增殖的标志性核抗原。Ki-67表达于细胞周期的G1、S1和G2期而在G0期无表达，2000年klein等[18]对将Ki-67蛋白含量作为细胞增殖评价方法进行了研究，并与传统的细胞毒评价方法进行了对比，他认为ELISA法检测Ki-67蛋白含量的方法是一种快速可靠、无放射污染的细胞增殖率评价的新方法，并建议作为国际标准ISO 10993-5细胞毒性评价的补充方法。3.3热休克蛋白检测

热休克蛋白含量检测是含汞牙科材料细胞毒性研究的一种评价方法。热休克蛋白(heat shock protein，HSP) 与细胞间反应密切相关, 是细胞反应的一个标志性分子，也是公认的在多种生物过程中起作用的重要蛋白质[19]。细胞在受到外界刺激时，热休克蛋白参与细胞自我保护和细胞损伤的修复。Oshima等1997年提出热休克蛋白的检测可以作为牙科材料细胞毒评价新方法的可能性[20]，随后他又采用热休克蛋白(HSP70) mRNA含量检测法对含汞牙科材料进行了毒性评价，提出热休克蛋白(HSP70)含量检测可以作为含汞牙科材料的细胞毒评价方法，且较传统的中性红比色法敏感[21]。

4.细胞毒性机制研究及其研究方法

事实上如果生物材料对机体的影响已经在整体水平和细胞水平上表现出来，那么在分子水平的基因表达方面势必已经造成影响，并且会极灵敏地反映出来。所以借助分子生物学等研究方法可以从分子水平上了解材料与细胞相互作用的机制。目前常用的研究方法包括流式细胞仪技术、细胞原位杂交法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和DNA微阵列技术等。如Gu等[22]对丝素纤维与外周神经组织的体外生物相容性进行了研究，MTT法评价丝素纤维对细胞活力的改变，流式细胞仪技术评估细胞的增殖能力，RT-PCR法检测丝素纤维对雪旺氏细胞神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF) mRNA的含量，综合评价出丝素纤维与外周神经组织的体外生物相容性良好。宁丽等[23]采用细胞原位杂交试验观察医用硅橡胶对体外原代培养的成骨细胞骨桥蛋白（osteopontin）的mRNA基因表达的影响，结果显示无毒性的硅橡胶不影响成骨细胞骨桥蛋白mRNA基因表达，有细胞毒性的硅橡胶则抑制骨桥蛋白mRNA在成骨细胞中的表达。吕晓迎等[24]采用MTT法和基因表达图谱分析法对镍离子细胞毒性及毒性机制进行了研究。章非敏等[25]着重研究口腔材料生物相容性评价的新方法，利用流式细胞仪技术和RT-PCR法对5种牙体修复材料的细胞毒性和毒性机理进行了初步的探讨。综合以上研究，生物材料细胞毒性机制层面的研究，为从分子水平上评价材料的生物相容性提供了实验依据，也是常规细胞毒性评价的重要补充。

5.结语

综上所述，评价生物材料的体外细胞生物相容性试验方法较多，亦各有其特点。各试验方法之间虽然存在一定的相关性，但是很难达到完全一致性。众多研究表明，不同细胞毒性评价方法对不同生物材料的敏感程度不同，原因可能在于不同的化学物质其毒理作用机制不同，而立足于不同生物学终点的评价方法显示出了不同的敏感度。2005年Weyermann等[26]对MTT法、LDH法和NUR试验三种试验方法进行了比较，并研究其毒性机制，结果发现LDH试验对于细胞膜完整性的破坏较敏感，而对于影响细胞内活动的一些毒性物质反应不敏感；MTT试验法主要对影响线粒体酶活性的毒性反应敏感，对于溶酶体破坏相关的细胞毒性，NUR检测灵敏度较高。因此在选择试验方法时，必须根据“最接近应用状况”的原则，合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学终点的评价指标或评价方法。综合运用分子水平评价方法，阐明材料对细胞的作用机制，全面地评价生物材料对细胞的毒性作用，将是生物材料细胞生物相容性评价的发展方向。

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