反向遗传操作技术在猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗研发中的应用

郭泗虎，曹宗喜，2，李海琴，闫明菲，亓文宝，焦培荣，张桂红

（1.华南农业大学兽医学院 农业部兽用疫苗创制重点实验室，广东 广州510642；2.海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南 海口571100）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起猪的一种高度传染性疾病。该病自1987年首次发现以来，已遍及世界各个养猪国家［1］，它所引发的母猪流产和仔猪的呼吸障碍给养猪业造成了灾难性的打击。特别是2006年以来，变异株PRRSV的出现则对我国养猪业的发展产生了巨大的影响［2］。

本文从PRRSV疫苗情况、PRRSV反向遗传系统的介绍、反向遗传操作技术对病毒致弱作用的研究、反向遗传操作技术在基因缺失标记疫苗的研究这4个方面就反向遗传操作技术在PRRSV疫苗研发中的应用做一综述。

1 PRRSV疫苗

目前普遍应用两种商品化疫苗来预防和控制PRRSV，分别是减毒活疫苗MLV（又称弱毒苗）和灭活苗。弱毒苗从1994年应用以来，对同源株具有有效的保护效力，但对异源株的保护作用不明显。当前所使用的 MLV面临许多问题［3］：疫苗株易失活，存在持续感染性，不完全的保护力及毒力返祖等。实验性的亚单位疫苗是利用质粒、细菌、杆状病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒等为载体携带包括GP5，M和GP3等几种抗原而发展起来的对抗PRRSV的疫苗［4］。在这些亚单位疫苗中，利用GP5串联M或GP3的多抗原疫苗免疫动物后能产生较高的中和抗体和较强的淋巴细胞增殖反应，但这些亚单位疫苗是否比现有的MLVs或灭活苗的免疫效果好还有待于进一步验证。

2 PRRSV反向遗传系统

RNA 病毒的反向遗传学研究是从病毒基因组入手研究基因的结构与功能、研究病毒的致病机理以及其他相关内容。其核心是建立病毒的感染性克隆，并通过一定的方法和途径实现病毒的遗传拯救，即病毒的人工构建。

目前PRRSV反向遗传操作技术具体方法大致有两种，第一种方法是RNA病毒基因组先经过反转录成为病毒cDNA，接着克隆到合适的转录表达载体上，克隆到转录启动子下游，在体外转录合成病毒的基因组RNA，然后再将这些体外转录本转染宿主细胞，使之在宿主细胞内包装形成具有感染性的病毒粒子，最后从细胞培养物中回收病毒，得到感染性分子克隆。欧洲型代表株LV和北美型代表株VR－2332的全长感染性克隆的构建都是基于这种方法建立起来的［5－6］。T7或SP6启动子插入全长病毒基因组cDNA的前端来驱动病毒的体外转录［6－7］。目前，这种方法已成功拯救出两种不同基因型PRRSV，并且广泛应用于病毒基因组功能的研究上。另一种方法是经反转录的cDNA克隆到表达载体上获得具有感性的cDNA，再将该质粒转染细胞，经细胞内转录生成具有感染性的病毒RNA，获得重组病毒。Huang［8］等用该系统拯救出表达GFP的PRRSV，通过测定GFP在转染细胞中的表达水平及拯救病毒的滴度来研究病毒的拯救效率。结果表明，与第一种方法相比，其拯救效率高10～50倍。利用改进的这种方法，绕过RNA体外转录这一步骤，使得研制疫苗MLV的过程大大减低了成本和节省了时间。

3 反向遗传操作技术与病毒致弱

了解PRRSV致病机理是研制致弱疫苗的关键。Kwon［9］等将构建的致弱疫苗株的全长感染性cDNA克隆的特定区域与高致病性毒株的感染性cDNA克隆的同等区域进行置换，然后再分别将嵌合构建体转染入细胞拯救出变异毒株，并接种怀孕母猪。结果显示，NSP3－8和ORF5可能包含主要的毒力决定区，NSP1－3，NSP10－12及 ORF2等区域与毒力相关。于此类似，Wang［10－11］等利用两株不同类型的PRRSV毒株（减毒Ingelvac PRRS MLV和MN184毒株）成功构建了嵌合的PRRSV感染性cDNA克隆，这两种互补嵌合的cDNA克隆分别用一毒株基因组的5′－UTR／ORF1与另一株的ORF2－7／3′－UTR 融 合。以 Ingelvac PRRS MLV 株 5′－UTR／ORF1为骨架的嵌合毒组表现出与亲本毒株相似的抗体反应，但与MN184组相比致病性减弱。它与以Ingelvac PRRS MLV株为骨架嵌入MN184株的ORF5－6而构建的嵌合体相似，分别能够保护猪只免受变异株SDSU73和JA142的攻击。此外，Gudmundsdottir［12］等用嵌合病毒在体外感染PAM来评价毒力影响因子对宿主免疫反应的影响，表明位于ORF1a区域的NSP1－8发挥着重要的调节作用。

以上结果表明，与利用细胞传代培养而获得减毒疫苗株的传统方法相比，应用嵌合感染性cDNA克隆技术与野毒株基因组的ORF5－6区域进行简单置换可以较快的致弱病毒毒力，同时，这个新的嵌合毒还能够提高疫苗对变异株的保护效力。至于Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV毒株之间的区域进行置换构建嵌合病毒还有待于进一步研究。

4 反向遗传操作技术与基因缺失标记疫苗

利用血清学的检测方法不能区分疫苗免疫猪和自然感染猪是当前弱毒苗的最大应用缺陷，而用反向遗传操作技术对病毒基因组特定区域进行缺失，进而构建新的标记疫苗或鉴别疫苗，这在控制和最终净化PRRSV方面具有重要价值。由于Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV基因组的NSP2区域都能够耐受大片段缺失，并且这些缺失区域具有一些与免疫优势相关的 B 细胞表位［13－14］。de Lima［15－16］等将 NSP2区缺失了一处B细胞表位的PRRSV变异株免疫接种怀孕母猪，能够诱导机体产生特异性N蛋白抗体，但不能够产生针对缺失表位的特异性抗体，能够利用针对缺失表位的特异性ELISA方法进行能分区疫苗免疫猪和自然感染猪，且突变毒株与亲本毒表现出相类似的毒力表型。这表明NSP2区域可以作为标记性的抗原表位的缺失区域。

Kim［17］等用NSP2区缺失了免疫表位ES4表达GFP的Ⅰ型PRRSV株感染保育猪21d后，所产生的抗N蛋白抗体的水平与亲本的重组病毒相似；与亲本毒株相比，表达GFP的突变株毒力减弱，并表现出较轻的病毒血症。ELISA检测表明，接种了突变株的猪只不能够产生对抗缺失表位的抗体，在感染14d后可以检测到针对GFP的抗体；但重组EGFP的毒株在细胞传代中EGFP荧光逐渐消失［18］，说明在NSP2区域引入标记位点缺乏遗传稳定性。

Fang［18］等对氨基酸序列分析发现，ES4表位在Ⅰ型PRRSV株的NSP2序列中是高度保守的，用4株具有代表性的Ⅰ型PRRSV野毒株感染猪只后，并利用针对ES4表位的特异性ELISA方法可检测出抗ES4抗体，这表明ES4表位缺失毒株可以用来作为一种PRRSV的标记疫苗，用以区别Ⅰ型PRRSV野毒株。但对Ⅰ型和Ⅰ型PRRSV基因序列进行比对后发现，ES4表位并不是保守的，因此基于Ⅰ型PRRSV ES4表位设计的区分疫苗免疫和自然感染的方法不适用于Ⅱ型PRRSV疫苗的区分。但这为将来合理设计PRRSV基因缺失疫苗及其相应的检测方法具有借鉴意义［16，18］。

5 结语

反向遗传操作技术不仅为研究病毒蛋白在PRRSV复制及其致病性作用方面提供了一个强有力的工具，而且在研制MLVs方面拓宽了视野，即通过对病毒基因组进行操作，旨在获得变异致弱株来达到研制MLVs的目的。这种疫苗能够有效的诱导体液和细胞免疫应答反应，增强了对这种疾病的保护力。与传统的由细胞连续盲目传代获得的MLVs相比，这种疫苗更加安全和可靠。在研制有效的亚单位疫苗和基于反向遗传技术MLVs方面，面临的最主要限制还是世界范围内PRRSV遗传多样性。而目前基于反向遗传技术的疫苗大多数都是基于PRRSV的单一毒株制成的，这样的疫苗对野毒株能否提供完全保护力仍需要进一步研究。

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