益生菌在消化道中的抑菌作用

东北农业大学动物科学技术学院 刘延国 张 琳 冯香安 李 杰＊

由于抗生素存在药物残留和耐药性的问题，给动物和消费者健康都带来了危害。因而抗生素作为促生长饲料添加剂将会受到更严格的限制。在此情况下，无药物残留和抗药性问题的益生菌添加剂将有广阔的应用前景。孔令勇和许国新（2003）在益生菌取代抗生素对肉鸡生产性能的影响中结果显示，使用益生菌的试验组日增重较快、料肉比和死淘率较低。何明清和谢镜怀（1986）试验发现：在仔猪腹泻发生初，空肠内的大肠杆菌由原来的对数值5.0±1.5上升为 6.4±0.9（P＜0.01）；直肠内由7.1±1.0上升为7.7±0.9（P＜0.05）。说明致病性大肠杆菌迅速繁殖导致肠内细菌区系紊乱，宿主抵抗力下降发生腹泻。所以抑制大肠杆菌等致病菌的繁殖和生长是动物预防疾病，提高生产性能的重点之一。郝生宏等（2008）在0～3周龄肉仔鸡日粮中分别加入地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳链球菌和啤酒酵母，均都能显著提高成活率，降低腹泻率并改善盲肠菌群。许多研究发现，益生菌及其代谢产物可以抑制消化道内致病菌的生长，降低仔猪腹泻率，提高生产性能。能在肠道中定植是益生菌发生作用的前提，但在肠道内能生存并稳定下来的微生物，必须能耐受种种不利环境的考验，包括胃酸、胆盐、肠道蠕动、消化酶、免疫反应、内源的微生物以及生产的抗菌物质等。所以益生菌的耐受性（耐酸、耐胆盐能力等）也是衡量益生菌能否发挥益生作用的基本指标。

1 益生菌

益生菌是指对人、动物有益影响的那些活性微生物，在通过摄入一定的数量后，对宿主产生一种或多种特殊的能产生超越其固有的基本营养价值的保健作用。2002年欧洲权威机构欧洲食品与饲料菌协会给出最新定义：益生菌是活的微生物，摄入充足的数量后，对宿主产生一种或多种特殊且经论证确实存在的健康益处（裴志花，2010）。

美国 FDA及 AAFCO（1989）列出了 42种可以直接饲喂且认为是安全的微生物品种，但作为饲用微生物添加剂的主要有乳酸菌属、粪链球菌、芽孢杆菌、仙人山属菌等。中国农业部1999年公布允许使用的饲料级微生物有12种。依照上述益生菌种的选择标准，目前作为益生菌种应用最多的为乳酸菌、双歧杆菌和芽孢杆菌。在生产中应用的益生菌制剂多为这些益生菌单一或多种菌株混合制剂。

2 益生菌的抑菌作用

2.1 通过生物夺氧方式阻止病原菌的繁殖 益生菌种的某些菌株，如需氧芽孢杆菌，以孢子状态或其他活菌形式进入畜禽消化道后生长繁殖，消耗肠内的氧气，造成局部厌氧环境，利于专性厌氧菌（如乳杆菌、双歧杆菌和肠球菌等）的定植和生长。使肠内正常微生物之间恢复平衡状态，抑制致病菌的生长。康白等（1992）给下痢仔猪连续3 d口服蜡样芽抱杆菌后，肠内需氧菌与厌氧菌之比由下痢时的1∶1恢复到健康时的1∶100，厌氧菌中双歧杆菌和乳酸杆菌显著增加，而大肠杆菌、沙门氏菌显著减少。乳酸菌的异型发酵会生成二氧化碳，可以抑制霉菌和一些革兰氏阴性菌。由于二氧化碳的蓄积，造成厌氧环境，抑制了需氧微生物的生长。研究表明，混合气体中二氧化碳的浓度超过30%时，就可以抑制细菌生长。

2.2 通过黏附机制和竞争排斥作用阻止病原菌的繁殖 黏附是致病菌定植于肠道的前提条件，对致病菌黏附的抑制可干扰其对细胞的侵袭。李树鹏和赵献军（2004）指出，许多益生菌可以通过与致病菌竞争肠上皮微绒毛上的脂质和蛋白质上的相同复合糖受体来达到阻止致病菌的定植。双歧杆菌通过脂壁磷酸黏附于肠上皮细胞，构成一层菌膜屏障，并产生细胞外糖苷酶，降解上皮细胞上作为潜在致病菌及其定植，形成肠道化学保护屏障，可保护肠道内的微环境，阻止致病菌的侵入、黏附和定植。而营养的竞争发生在小肠上皮细胞，主要是由于益生菌能够抢先吸收利用小肠上皮细胞内的营养物质进行生存和繁殖，抑制有害菌在消化道的增殖。有研究者用嗜酸乳杆菌与肠致病菌一起同Caco-2细胞系（具有人小肠微绒毛细胞的某些特性）培养，发现肠致病菌的黏附能力受抑制。傅晓丽等（1999）的研究表明，嗜酸乳杆菌对侵袭性大肠埃希菌、产毒性大肠埃希菌和痢疾志贺菌均具有明显的黏附拮颃作用。Fujiwara等（2001）研究发现，长双歧杆菌Bifidobacterium longum SBT 2928可以分泌一种被称为黏附抑制因子的蛋白质，这种蛋白分子可以有效地抑制肠毒性大肠杆菌Pb176对糖脂受体GA1的黏附以及对肠上皮样细胞HCT-8的黏附。嗜酸乳杆菌可显著降低用大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌接种过的仔鸡的死亡率，并能抑制这些病原菌在肠道内定植。Muralidhara等（1997）给刚出生的仔猪饲喂乳酸杆菌，试验结果表明，粪便中乳酸杆菌与大肠杆菌的比例达到1280∶1，而对照组的比例为2∶1，高比例的乳酸杆菌可以保护动物抵抗肠致病性大肠杆菌的侵袭，预防腹泻。王斌等（2006）研究表明，路氏乳杆菌JCM1081可以抑制致病性大肠杆菌对肠上皮样细胞HT-29的黏附（28%）和侵袭（27.7%），并可减弱致病性大肠杆菌对细胞的损伤。

像致病菌一样，益生菌在肠道的黏附也是定植的先决条件。许多研究结果表明，菌体黏附能力的大小与其凝集能力和菌体表面疏水特性呈正相关关系。研究证实，乳酸菌的凝集可以形成阻止致病菌定植和感染的屏障。刘勇等（2010）对4株益生菌的表面特性的研究中发现，益生菌对致病菌有凝集能力，对致病菌凝集率随益生菌、致病菌和培养时间的变化而不同。具有较高自凝集能力的菌株，其疏水能力及对致病菌的凝集能力也较高。

2.3 通过发酵产生代谢产物和生理活性物质抑制病原菌 益生菌除了自身可以抑菌以外，其代谢产物也有很强的抑菌作用。某些乳酸杆菌和链球菌可产生细菌素、过氧化氢、二氧化碳、有机酸等，它们在体外具有抑制沙门氏菌、假单胞菌、葡萄球菌、变形菌等细菌生长的作用。单春乔等（2009）研究发现，嗜酸乳杆菌SR-1代谢产物对15种常见的抗生素有耐药性；pH值为3.0时，其有广谱的抗菌活性，对35种常见革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌均有明显的抑制作用，但对肠道内益生菌无抑制作用；在与致病菌混合培养40 h内可以彻底清除金黄色葡萄球菌，48 h内可以完全消灭大肠杆菌。

2.3.1 产酸 乳酸菌产生的乳酸、乙酸等酸性产物可抑制病原菌生长繁殖。Jin等（1996）研究发现乳杆菌对大肠杆菌有抑制作用，代谢产物pH调至6.5时，则不再产生抑菌圈，并此推断其抑菌物质主要为乳酸。赵佳锐等（2006）在肠道益生菌体外抑菌试验中证实了细菌发酵浓缩液中乙酸和乳酸在低pH条件下的抑菌作用。王凯等（2008）选择72头断奶仔猪研究了饲喂乳酸菌制剂对断奶仔猪肠道生理生化指标的影响。研究结果表明，以1.5%乳酸菌制剂拌料发酵6 h后饲喂仔猪，盲肠、结肠和直肠后段内容物pH分别显著下降0.77、0.79和0.26，后肠段和粪中大肠杆菌数和总细菌数均无显著差异，但盲肠乳酸杆菌数有显著提高。

2.3.2 产生细菌素 乳酸菌能产生类细菌素物质，对病原菌有抑制作用。王柏琴等（1996）报道乳酸乳球菌产生的Nisin细菌素可以抑制链球菌、葡萄球菌和梭状芽孢杆菌的生长。乳酸菌能产生细菌素，对革兰阳性细菌产生抑制或杀死作用（Ward 等，1990）。Dunne等（1999）发现，唾液乳杆菌的抗菌产物ABP 118（一种细菌素）对一系列潜在病原菌均有较广谱的抑菌性。陈红梅等（2008）研究表明，从整个仔猪阶段（14～70日龄）综合各方面的效果来看，哺乳仔猪饲粮中添加10%乳酸菌素、断奶仔猪饲粮中添加0.4%乳酸菌素均可极显著提高日增重、粗纤维的表观消化率；明显降低粪中大肠杆菌数量，从而减少了仔猪腹泻的发生。吴荣荣等（2009）证明，菌株嗜酸乳杆菌A、戊糖片球菌M和戊糖片球菌T所产的细菌素对多种革兰氏阳性、阴性细菌有显著的抑制作用，对部分真菌也有不同程度的抑菌效果，抑菌谱较宽。罗璠（2010）在动物乳杆菌发酵液的体外抑菌试验中也发现，除酸后的发酵液对大肠杆菌、沙门氏杆菌、金黄葡萄球菌等有明显的抑制作用。不同的试验结果都显示了细菌素对致病菌的繁殖有明显的抑制作用。

除此之外还能产生过氧化物（H2O2）、酶类、双乙酰。嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌可以产生H2O2，抑制葡萄球菌等病原菌的生长繁殖。激活动物大肠内的过氧化氢酶-硫氰酸盐反应系统，使乳酸过氧化物酶与H2O2结合，然后将硫氰酸盐氧化成氧化性中间产物，抑制葡萄球菌等病原菌的生长繁殖（闵晓梅等，2001）。研究发现，双歧杆菌和乳酸杆菌产生的胞外糖苷酶，还可降解肠黏膜上皮细胞的复杂多糖，而这些多糖是致病菌和细菌毒素的潜在受体，因此可以阻止毒素在上皮细胞的粘附和侵入。保加利亚乳酸杆菌的代谢产物能够中和大肠杆菌外毒素，许多好氧菌产生的代谢产物可帮助动物消除氧自由基。饲喂啤酒酵母后，肠道内有益菌群大量增殖，它们不仅抑制潜在病原菌，也能阻止肠内胺和氨产生、促进肠蠕动、维持完整的肠粘膜结构。乳酸菌的各个属在糖代谢同时都可产生双乙酰，这种化合物对许多病原菌都有抑制作用。

2.4 帮助建立和维持正常的肠道优势菌群 在动物体消化道内，当有益菌处于优势菌群状态时，机体才能维持健康。给成年动物或其体内的非有益菌区系补充双歧杆菌、乳酸菌等益生菌有利于优势菌群的建立，维持正常微生态系统的平衡。孟祥晨和霍贵成（2004）在双歧杆菌对正常小白鼠肠道菌群的影响研究结果显示，试验组与对照组相比，双歧杆菌数量显著增加，肠杆菌数量显著下降，而乳杆菌有轻微增长，但差异不显著。张常明等（2006）研究了在基础日粮中添加植物源乳酸菌制剂对二元杂阉公猪肠道菌群结构的影响。结果显示，添加组消化道各段内容物pH都有所降低，乳酸菌数量不同程度地高于对照组，且在胃底、十二指肠、空肠等部位都达到了显著水平，盲肠和结肠内容物中大肠杆菌的数量也有显著降低。不同试验表明，益生菌能抑制致病菌繁殖，改善胃肠道内微生态平衡。

3 消化道环境对益生菌的影响

动物胃肠道的胃酸、胆盐和多种消化酶类对益生菌都有潜在的灭活作用，抵御这些环境因素并保证足够的活菌数量是益生菌定植于动物肠道并发挥益生作用的前提。成年猪正常胃液的pH为2.0～3.5，初生仔猪的胃中pH为2.l，前3周龄哺乳仔猪胃中pH分别为3.7、3.9、3.4，补料后pH上升至4.9，以后逐步下降，60日龄后可逐步达到正常水平，正常情况下胃排空时间为4 h，pH随饮食结构变化，但基本上pH约为3.0。这个酸度对于许多乳酸菌来说是不耐受的，摄入的乳酸菌必须经过这个酸性环境，只有保证乳酸菌数量才能发挥益生作用。十二指肠中的胆盐能抑制其中的细菌繁殖，对哺乳仔猪而言，胆囊内胆汁量很少，在出生后3周内胆汁量缓慢增加，一般在0.03% ～0.3%（纪振杰，2008）。 胆盐具有很强的抗菌作用，对益生菌的抑制能力比酸性环境更强。这些因素都对益生菌的定植、繁殖有很大的影响。

饲用益生菌进入消化道后对其耐受力低，难以有足够的活菌数量到达肠道或定植肠道而发挥作用（郝生宏等，2005）。林朝洪（2007）在对从消化道分离出的75株乳酸杆菌进行耐酸试验发现：从消化道前段分离的菌株对酸的耐受性比从消化道后段分离出的菌株好。从胃分离的7个菌株对酸有较强的耐受性，其中4株的存活率达80%以上，另3株甚至超过90%。从直肠分离出的菌株耐酸性最差。辛羚等（2005）证明乳酸杆菌在pH值为2.5～4.5的人工胃液中具有较强的生存能力，2.5 h活菌数仍达108CFU/mL左右；在人工肠液和0.3%胆盐中仍能存活。陈欣等（2006）研究证明：芽孢杆菌对人工胃液的耐受性很强，菌数基本无差异；乳酸杆菌和乳酸链球菌在70%胆盐下8 h能存活。张璐（2008）试验显示枯草芽孢杆菌对低pH和高胆盐的耐受能力很强，相比之下蜡状芽孢杆菌的耐受性较低，在pH为2时存活率为46.2%，地衣芽孢杆菌在0.3%禽胆盐下存活率为37.7%。许多试验结果显示消化道环境对益生菌的定植、繁殖有很大影响，不同的菌种对低pH和高胆盐的耐受能力不同。如何提高益生菌的耐受性或者筛选出耐受性高的菌种在益生菌的生产应用中有重大的意义。

4 小结

综上所述，益生菌作为抗生素的替代物，不仅对大肠杆菌、沙门氏杆菌、葡萄球菌有很好的抑制作用，同时分泌消化酶促进代谢，帮助建立良好的胃肠道微生物环境等作用；一些益生菌对胃肠道环境也有一定的抵抗能力，为其在肠道定植发挥益生作用提供了保证。但是对于消化道内土著微生物对益生菌的影响及益生菌在食糜中发挥抑菌作用的能力研究较少，多数益生菌在消化道中的耐受力不高也是制约益生菌广泛应用的问题之一，如何解决以上问题将会是未来研究的重点。

[1]陈红梅，赵恒寿，韩彦珍，等.乳酸菌素对仔猪生产性能、饲料养分表观消化率及粪大肠杆菌数量的影响[J].养猪，2006，4：3～5.

[2]陈欣,潘素华,胡黎黎，等.人源乳酸杆菌耐酸耐胆盐能力的测定和鉴定[J].现代预防医学，2006，33（3）：278 ～ 279.

[3]单春乔，吴磊，刘秋晨，等.嗜酸乳杆菌SR-1发酵代谢产物的体外抑菌试验分析[J].兽医科技，2009，3：76 ～ 78.

[4]傅晓丽，徐建国，高守一.嗜酸乳杆菌对致泻性大肠埃希氏菌上皮细胞粘附和侵袭的抑制作用[J].中华微生物学和免疫学杂志，1999，19（2）：97～101.

[5]郝生宏，佟建明，萨仁娜，等.四株耐制粒益生菌对0～3周龄肉仔鸡死亡率、腹泻率及盲肠菌群的影响[J].中国饲料，2008，3：30～32.

[6]郝生宏，杨荣芳，佟建明，等.饲用益生菌在研究和应用中存在的问题[J].中国饲料，2005，12：17 ～ 18.

[7]何明清，谢镜怀.病、健仔猪不同肠段菌群的研究[J].畜牧兽医学报，1986，12（4）：276 ～ 283.

[8]纪振杰.高抗逆性双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的筛选及应用研究[D].哈尔滨：黑龙江农垦大学，2008.

[9]孔令勇，许国新.益生菌取代抗生素对肉鸡生产性能的影响[J].中国饲料，2003，3：23 ～ 24.

[10]康白，何明清，集宁，等.蜡样芽孢杆菌对羔羊、仔猪和鸡腹泻控制的流行病学分析[J].中国微生态学杂志，1992，4（4）：40 ～ 48.

[11]李树鹏，赵献军.益生素与机体免疫作用研究进展 [J].家畜生态，2004，25（4）：134 ～ 138.

[12]林朝洪.猪源益生乳杆菌的分离、鉴定和筛选及E租C-PCR分型研究[D].雅安：四川农业大学，2007.

[13]刘勇，张勇，包艳，等.4株益生菌的表面特性及抑制致病菌作用研究[J].中国食品学报，2010，10（2）：28 ～ 32.

[14]罗璠.动物乳杆菌发酵液的体外抑菌试验[J].四川畜牧兽医，2010，6：26～27.

[15]孟祥晨，霍贵成.双歧杆菌对正常小白鼠免疫调节及肠道菌群的影响[J].东北农业大学学报，2004，35（4）：458 ～ 464.

[16]闵晓梅，孟庆翔.动物胃肠道正常微生物与活菌制剂在猪生产中的应用[J].养猪，2001，1：9 ～ 12.

[17]裴志花，王开，马红霞.益生菌及其在养禽业中的应用[J].中国畜牧兽医，2010，37（5）：30 ～ 32.

[18]王斌，但国蓉，袁静，等.乳杆菌黏附抑制致病性大肠杆菌对肠上皮样细胞侵袭的初步研究[J].解放军医学杂志，2006，6：550～552.

[19]王凯，马金磊，赖婷，等.乳酸菌剂对断奶仔猪肠道生理指标的影响[J].中国兽医杂志，2008，44（9）：21 ～ 23.

[20]王柏琴，杨洁彬，刘克.红曲色素、乳酸链球菌素、山梨酸钾对乳酸菌株的影响[J].食品与发酵工业，1996，2：5 ～ 8.

[21]吴荣荣，张良，王倩.产细菌素乳酸菌的选育及其抑菌特性的研究[J].中国酿造，2009，6：20 ～ 22.

[22]辛羚，郭本恒，吴正钧.3株乳杆菌在模拟消化环境中存活性能的研究[J].中国乳品工业，2005，33（5）：15 ～ 17.

[23]张常明，李路胜，王修启，等.乳酸菌对断奶仔猪生产性能及免疫力的影响[J].华南农业大学学报，2006，27（3）：81 ～ 84.

[24]张璐.饲用芽孢杆菌产品益生特性的体外评价研究[D].北京：北京畜牧兽医研究所，2008.

[25]赵佳锐，范小兵，杭晓敏，等.肠道益生菌体外抑菌活性的研究[J].中国微生态学杂志，2006，18（2）：88 ～ 90.

[26]Dunne C，O’Halloran S，O’Mahony L，et al.In vivo and in vitro adhesion to epithelium of probiotic microorganisms[J].Gastroenterology，1999，116：4（2）：G3058.

[27]Fujiwara S，Hashiba H，Hirota T，et al.Inhibition of the binding of enterotoxigenic Escherichia coli Pb176 to human intestinal epithelial cell line HCT-8 by an extracelluar protein fraction cotaining BIF of Bifidobacterium longum SBT2928：suggestive evidence of blocking of the binding receptor gangliotetraosylceramide on the cell surface·Int[J].Food Microbiol，2001，67（1～ 2）：97.

[28]Jin L Z，Marquardt R R，Baidoo S K.Inhibition of enterotoxig-nic Eseheriehia coli K88，K99 and 987P by the Lacrobacillusi-solates from Porcine intestine[J].Journal of the Science of Food and Agrieulture，2000，80：619 ～624.

[29]Muralidhara K S.Effect of feeding lactobacilli on the coliform and Lactobacillus flora of the intestinal tissue and reces from pigs[J].Food Prot，1997，40：288～295.

[30]Ward D M，Weller R，Batesonmm.16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganismsin anaturalcommunity[J].Nature，1990，345（6270）：63 ～ 65.