CD4+CD25+Treg细胞、TGF-β1和IL-10在上皮性卵巢癌中的变化

沈 玮 田 庚 (吉林省妇幼保健院，吉林 长春 3006)

CD4+CD25+调节性 T细胞(regulatory T cell，Treg)是健康个体T细胞库的组成成分，是一类具有免疫抑制效应的细胞，能抑制T细胞对外源和自体抗原的免疫反应，因此在维持对自身成分免疫耐受的同时，也可能阻止机体对自体同源肿瘤细胞的免疫。因此，CD4+CD25+Treg细胞很可能影响着免疫系统对肿瘤抗原的应答，从而影响肿瘤的发生和发展。CD4+CD25+Treg细胞可通过分泌抑制性细胞因子TGF-β1和IL-10发挥免疫下调作用〔1〕。

Brunkow等〔2〕报道，胸腺和外周淋巴组织中自然产生的CD4+CD25+Treg细胞可特异表达一种转录因子Foxp3，Foxp3是Treg细胞发育的一个关键转录因子〔3〕。

本文检测上皮性卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞数量及其相关基因Foxp3 mRNA的表达以及TGF-β1和IL-10含量的变化，探讨CD4+CD25+Treg细胞与肿瘤发生、发展的关系及临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 卵巢癌患者20例(来自吉林大学第二医院)，其中浆液性囊腺癌13例，黏液性囊腺癌7例，年龄28～64〔平均(43.14±9.48)〕岁。非肿瘤患者10例作对照，年龄21～53〔平均(37.4±10.26)〕岁。肿瘤患者术前未进行放、化疗，抽取静脉血2 ml，EDTA抗凝。所有病例均手术病理确诊。

1.2 标本采集、处理 EDTA抗凝血2 ml，应用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，计数，取1×106个细胞标记抗CD4-PE单克隆抗体和抗CD25-FITC单克隆抗体进行FACS检测，剩余细胞加入Trizol试剂后置－80℃冰箱冻存，备RT-PCR检测。外周静脉血3 ml，4℃静置3 h，3 000 r/min离心20 min，分离血清，－70℃储存以备ELISA检测使用。重组TGF-β1及IL-10 ELISA试剂盒购自上海森雄公司。

1.3 FACS检测 荧光抗体标记的淋巴细胞悬液4℃下避光孵育30 min，PBS洗涤，然后进行FACS检测。

1.4 RT-PCR反应 cDNA的逆转录采用Takara的AMV RTase，按说明书进行操作。通过预实验确定PCR反应条件和最适循环数，以保证PCR产物量与起始cDNA量呈线性相关。①人Foxp3的引物:正义5'-CTACGCCACGCTCATCCGCTGG-3'和反义:5'-GTAGGGTTGGAACACCTGCTGGG-3'，片段大小为260 bp。②内参β-actin引物序列为:正义:5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3';反义:5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3'，片段大小:224 bp。采用Ex Taq DNA聚合酶，反应条件为:94℃预变性 5 min，随后进行40 次循环(94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s)，最后72℃延伸10 min。

1.5 RT-PCR产物的检测 取5 μl PCR产物点样于1.5%的琼脂糖凝胶，其中含0.5 μg/ml溴乙锭。5 V/cm进行电泳，凝胶扫描成像系统记录电泳结果。用Imagemaster VDS(Pharmacia Biotech)图像分析软件分析光密度值，以Foxp3/β-actin光密度比值表示Foxp3 mRNA表达水平，琼脂糖电泳以100 bp DNA ladder V(鼎国)相对分子质量为标准，实验各组RT-PCR扩增的Foxp3及β-actin条带与相对分子质量标准位置相同。

1.6 TGF-β1和IL-10含量的测定 按TGF-β1及IL-10 ELISA试剂盒说明书绘出标准曲线。利用同一条件下测得的标本OD值，实验组和对照组血清浓度依标准曲线查出，计算浓度时乘以稀释倍数。

2 结果

2.1 各组外周血中CD4+CD25+/CD4+T细胞比例的差异

浆液性囊腺癌患者外周血CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例〔(23.48±12.23)%〕较非肿瘤病人〔(11.17±7.35)%〕明显增高(P＜0.05)。黏液性囊腺癌病人外周血CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例〔(21.41±8.91)%〕与非肿瘤病人相比较也明显增高(P＜0.05)。

2.2 人PBMC中FOXP3 mRNA的表达 浆液性囊腺癌〔(6.28±1.08)%〕和黏液性囊腺癌〔(5.17±0.95)%〕病人外周血PBMC中Foxp3 mRNA表达量均明显高于非肿瘤病人〔(3.43±0.51)%〕(P＜0.05)。

2.3 外周血中TGF-β1、IL-10的含量 浆液性及黏液性囊腺癌患者外周静脉血中 TGF-β1的含量〔(51.48±12.23)%，(49.41±10.91)%〕较非肿瘤病人〔(18.17±7.35)%〕均明显增高(P＜0.05)。浆液性及黏液性囊腺癌患者外周静脉血中IL-10的含量〔(15.83+5.16)%，(16.56+4.24)%〕较非肿瘤病人〔(6.39+2.85)%〕也明显增高(P＜0.05)。

3 讨论

在生理状态下，机体免疫系统具有免疫监视作用防止肿瘤的发生。然而，研究表明在癌症患者中免疫系统对肿瘤抗原常表现为弱的免疫应答，从而不能有效清除肿瘤细胞，导致临床肿瘤的发生。这种对肿瘤抗原弱免疫应答的原因很可能是由于肿瘤抗原为变化了的自身抗原，因此，维持自身耐受的机制也在对肿瘤发挥着耐受作用，使之“逃逸”免疫监视。

研究表明，正常情况下机体内Treg的免疫学意义是维持机体免疫稳态，其作用方式是动态调节机体免疫平衡，有防止免疫反应无限制扩大及抑制自身免疫反应发生的作用。体内Treg的数量和功能状态对机体免疫稳态的维持有重要意义，理论上Treg数量过少或功能不足会出现相应的免疫性损害，甚至出现自身免疫性疾病。这种情况已在很多疾病中得到证实。但Treg数量过多或功能过强的情况不多，目前还主要在肿瘤患者上有报道。

CD4+CD25+Treg在机体内维持一定水平，因此在正常人外周血中能够检测到Treg表达，其表达水平可在一定程度上反映机体的免疫状况。但是，即使对于健康成人外周血的Treg水平，目前尚没有进行大规模普查，不同作者报道的表达值不尽相同，Dieckmann〔4〕报道 CD4+CD25+T细胞占 CD4+T细胞的比例为 2.8% ～17.2%，Ichihara等〔5〕报道为 7.2%，Jonuleit等〔6〕报道0.7% ～5.5%。Baecher-Allan等〔7〕报道为 10%. 这些报道均存在检测样本量较少的缺点，其数值不能代表Treg的正常值，只能说明其大致范围和相对变动情况。因为Treg可能随内外环境变化而出现较大范围的变动。为了解Treg在健康成人的外周血中表达情况，本文检测了10例健康成人外周血的Treg表达率，结果Treg占CD4+T细胞的比例为(11.17±7.35)%，与其他研究者报道类似，说明本研究所得结果基本属于正常表达范围，可以作为深入研究的对照基础。

大量的实验证据表明，由CD4+CD25+Treg细胞介导的对自身反应性细胞的调节也是自身免疫耐受建立的重要机制之一。因此，可以推测CD4+CD25+Treg细胞在维持自身耐受的同时，也可以抑制肿瘤免疫的发生。研究表明，CD4+CD25+Treg细胞可以通过不同的机制抑制不同类型的细胞参与的肿瘤排斥反应。Shimizu〔8〕等证实去除CD4+CD25+Treg细胞可诱导对同源肿瘤细胞的免疫反应，也可以促进肿瘤病变部位的前炎症反应，从而利于诱导对多种肿瘤抗原的免疫应答，证明了CD4+CD25+Treg细胞可以抑制体内抗肿瘤免疫反应。

Foxp3特异性地表达于Treg细胞，可作为Treg细胞的一个特异标志，而且调节着该类细胞的发育和功能。Foxp3是Treg细胞发育的一个关键转录因子。在人类Foxp3不仅可表达于CD4+CD25+T细胞〔9〕，还可表达于 CD8+CD28+T细胞(称为抑制性T细胞)〔10〕。表达Foxp3的T细胞均具有免疫抑制作用，推测Foxp3的表达可能是导致这些细胞发挥其抑制作用的主要原因。

本研究结果发现浆液性囊腺癌患者和黏液性囊腺癌患者外周血CD4+CD25+Treg细胞数量明显升高，并且外周血中Foxp3表达明显增强，表明浆液性囊腺癌患者和黏液性囊腺癌患者CD4+CD25+Treg细胞不但数量增加，而且功能增强。因此，有利于肿瘤耐受的形成，降低免疫系统对肿瘤免疫应答，促进肿瘤的发生和发展。

CD4+CD25+Treg细胞通过细胞间接触发挥抑制作用，另有研究认为该细胞能分泌免疫下调性细胞因子如TGF-β和IL-10等发挥免疫抑制功能，TGF-β1和 IL-10等细胞因子对CD4+CD25+Treg细胞的抑制功能有重要的作用，CD4+CD25+Treg细胞的接触依赖抑制作用受 TGF-β1 和 IL-10 调节〔11，12〕。IL-10能协助幼稚T细胞分化成为调节性T细胞，抑制树突细胞表达协同分子而间接抑制T细胞反应。而CD4+CD25+Treg细胞又可分泌IL-10，CD4+CD25+Treg细胞与IL-10间的正反馈调节可能促进免疫耐受。TGF-β1也是维持CD4+CD25+Treg细胞数量和功能的重要因子〔13〕，TGF-β1在体外可以诱导人外周血CD4+CD25+Treg细胞增生。一般认为CD4+CD25+Treg细胞膜表面结合的TGF-β1可能是细胞间相互作用的效应分子，抗TGF-β1单克隆抗体能明显削弱CD4+CD25+Treg细胞调控T细胞的抑制功能。TGF-β1在早期抑制上皮性卵巢癌生长，但在晚期促进上皮性卵巢癌的生长和转移〔14〕。TGF-β1和TGF-β3表达增强以及它们各自受体的缺失能促使肿瘤的产生和发展，使肿瘤更易复发，对化疗药物耐药。血管生成在卵巢癌发展和转移中是必不可少的，有研究发现TGF-β1阳性并伴有VEGF强阳性的血管密度明显高于TGF-β1阴性、VEGF弱阳性的血管密度。可见TGF-β1与VEGF共表达能促进血管生成，从而有利于血管的生长。

本文证实上皮性卵巢癌患者外周血中免疫抑制性因子TGF-β1和IL-10均较正常对照组明显增高。表明TGF-β1和IL-10与CD4+CD25+Treg细胞协同作用，引起免疫耐受，促进上皮性卵巢癌的生长和转移具有重要的作用。综上所述，CD4+CD25+Treg细胞是一种重要的具有免疫调节作用的T淋巴细胞，与免疫抑制性因子TGF-β1和IL-10协同作用，促进上皮性卵巢癌的进展和转移。但其作用机制及CD4+CD25+Treg细胞与TGF-β1，IL-10的相互影响，还有待深入研究。

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2 Brunkow ME，Jeffery EW，Hjerrild KA，et al.Disruption of a new forkhead/winged-helix protein，scurfin，results in the fatal lymphoprolifera-tive disorder of the scurfy mouse〔J〕.Nat Genet，2001;27(1):68-73.

3 Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY，et al.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells〔J〕.Nat Immunol，2003;4:330-6.

4 Dieckmann D，Plottner H，Berchtold S，et al.Ex vivo isolation and characterization of CD4+CD25+T cells with regulatory properties from human blood〔J〕.J Exp Med，2001;193(11):1303.

5 Ichihara F，Kono K，Takahashi A，et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers〔J〕.Clin Cancer Res，2003;9(12):4404.

6 Jonuleit H，Schmitt E，Stassen M，et al.Identification and functional characterization of human CD4+CD25+T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood〔J〕.J Exp Med，2001;193(11):1285.

7 Baecher-Allan C，Brown JA，Freeman GJ，et al.CD4+CD25 high regulatory cells in human peripheral blood〔J〕.J Immunol，2001;167(3):1245.

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9 Morgan ME，van Bilsen JH，Bakker AM，et al.Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+T regulatory cells in humans〔J〕.Hum Immunol，2005;66(1):13-20.

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