γ-synuclein在非小细胞肺癌中的表达

郑元元 蒋军广 赵 娜 刘瑞芬 杨 超 张婧雯 孙 曼 张晓燕

(郑州大学第一附属医院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南郑州 450052)

肺癌是威胁人类生命的重大疾病，其发病率和病死率逐年上升。由人γ突触核蛋白(γ-synuclein)基因(SNCG)编码的γ-synuclein为天然无折叠蛋白，是乳腺癌的分子标记物，近来研究发现它在卵巢癌、消化系肿瘤中异常高表达，在晚期肿瘤中表达尤其显著。γ-synuclein的过表达能够增加癌细胞的侵袭转移能力以及对某些化疗药物的耐受性，也使其成为潜在的治疗靶点。但国内外文献对于 γ-synuclein在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其临床意义报道不多。本实验应用免疫组织化学的方法检测γ-synuclein在NSCLC中的表达，试图探讨NSCLC的发生、进展和侵袭机制，期望对NSCLC的诊断、治疗及预后评估提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 随机选取60例2006年1月至2008年12月在郑州大学第一附属医院胸外科手术摘除的NSCLC病人的标本作为观察组，其中男44例，女16例，年龄36～75〔平均(57.92±17.04)〕岁。所有病人在手术前均未行任何抗肿瘤治疗。鳞癌34例，腺癌26例;高分化20例，中分化26例，低分化14例。按照美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(FIGO)2002年制定的分期标准:Ⅰ期16例，Ⅱ期12例，Ⅲ期21例，Ⅳ期11例。对照组为20例癌旁正常肺组织(距癌组织均＞3 cm)。所有标本均为甲醛固定、石蜡包埋组织。兔抗人γ-synuclein多克隆抗体浓缩型(Bioworld Technogy Inc)，生物素-链霉菌素-过氧化物酶(S-P)法通用试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京博奥森生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 采用S-P免疫组化法，严格按照S-P试剂盒说明进行，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。步骤:石蜡切片脱蜡水化，于枸橼酸盐缓冲液(pH6.1)中行微波抗原修复，过氧化物酶阻断剂阻断内源性过氧化物酶活性，非免疫性动物血清阻断非特异性反应，滴加兔抗人γ-synuclein多克隆抗体，4℃过夜，加生物素标记的第二抗体，加链霉抗生物素-过氧化物酶溶液，DAB显色后自来水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。

1.2.2 结果判定 以免疫组化染色后细胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒作为阳性判断标准。根据染色的程度分为3级:无着色(1级)评1分，浅黄色(2级)评2分，棕黄色(3级)评3分;高倍镜(400倍)下每个视野计数100个细胞，每张切片数5个视野。按照镜下阳性细胞数占癌细胞总数的百分比来综合判断，阳性细胞数≤25%评为1级(分)，26% ～75%评为2级(分)，≥76%评为3级(分)。最后每张切片的两次评分的乘积为其最终得分(1～9分)，＞7分的为阳性表达(+)，＜7分的为阴性表达(－)。

1.3 统计学方法 采用χ2检验及四格表资料的精确概率法，应用SPSS13.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 γ-synuclein在NSCLC组织中的表达 免疫组化结果显示，γ-synuclein免疫组化阳性产物主要定位于细胞质，也可见定位于细胞核。60例NSCLC组织中γ-synuclein表达的阳性率为46.7%(28/60)，20例正常肺组织无1例阳性表达(0%)，差异有统计学意义(P=0.000)。

2.2 γ-synuclein表达与NSCLC临床病理特征的关系 高中分化的NSCLC患者中γ-synuclein的阳性表达率为34.8%，低分化为85.7%，差异有统计学意义(P=0.001)。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者中γ-synuclein的阳性表达率为28.6%，Ⅲ、Ⅳ期患者γ-synuclein的阳性表达率为62.5%，差异有统计学意义(P=0.009)。伴淋巴结转移的NSCLC患者中γ-synuclein的阳性表达率为87.5%，不伴淋巴结转移的患者为19.4%，差异有统计学意义(P=0.000)。γ-synuclein的表达与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤的大小、病理类型、临床分型、有无胸腔积液及是否吸烟无关(均P＞0.05)。

3 讨论

synucleins是小分子可溶性蛋白质家族，目前有α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein 3个成员，主要在神经元表达，在突触前末梢尤为丰富。目前，对于他们的生物学功能还没有充分地了解，已有的研究结果显示他们与神经系统的发育及某些神经变性疾病有关。γ-synuclein是该家族的第三个成员，其表达组织特异性较高，广泛表达于脑组织中，主要位于细胞质和神经元的轴突内，在乳腺、肝脏、肾脏、肺脏、胸腺、心脏、卵巢、睾丸、前列腺、结肠和胎盘等组织中表达量极低或不表达。近来的研究发现，其表达异常不仅与神经退行性病变有关〔1，2〕，与细胞恶变也有一定的相关性。Ji 等〔3〕首先发现γ-synuclein在乳腺癌组织中高表达，并且恶性程度越高，其表达越高。随后发现其在胃癌、卵巢癌、肝癌、骨肉瘤、肺癌和前列腺癌等组织中也有异常高表达。

γ-synuclein有促进肿瘤细胞的生长分化，增加癌细胞活动，促进癌浸润转移的作用，其机制可能是:①增强基质金属蛋白酶 (MMP)活性。②与微管相关蛋白 (MAPs)相互作用。③抑制肿瘤生长抑制因子 (OM)。张惠卿等〔4〕的研究结果显示:在正常乳腺组织和良性乳腺病变中未见γ-synuclein表达，在乳腺癌中γ-synuclein阳性率为38.9%，并且γ-synuclein的表达与TNM分期及有无淋巴结转移有关，在早期 (0/Ⅰ/Ⅱ期)乳腺癌中轻度表达 (10.9%)，在晚期 (Ⅲ/Ⅳ期)乳腺癌中高表达 (80.8%)。动物实验淋巴结切片镜检显示，种植γ-synuclein阳性的瘤细胞组，75%存在肿瘤细胞转移，而阴性组只有24%。在远处肺转移中，γ-synuclein阳性组也远高于阴性组。类似的研究结果在卵巢癌、胃癌、骨肉瘤、胰腺癌等中均有报道，但是Zhou等〔5〕的研究发现在食管癌中γ-synuclein却是低表达的，被认为可能是食管癌的负性调节因子。Liu等〔6〕用免疫组化方法，在八种肿瘤 (肝癌、食管癌、前列腺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌)中检测γ-synuclein，均呈阶段性增高。发现这种同一种基因在不同细胞或不同肿瘤组织中的生物学和生物化学的功能不同并不意外，因为肿瘤的发展是一个有关多基因的复杂现象，是涉及多步骤的一系列基因事件结果。国内外对γ-synuclein在NSCLC中的报道很少，本实验结果显示:20例正常肺组织无1例阳性表达，60例NSCLC中γ-synuclein阳性表达率为46.7%;高中分化的NSCLC患者中的γ-synuclein的阳性表达率为34.8%，低分化为85.7%，差异有统计学意义 (P=0.001)，表明γ-synuclein的表达与NSCLC的分化程度密切相关，随着肿瘤分化程度下降，阳性表达率升高，推测γ-synuclein的表达呈恶性生物学行为;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者中γ-synuclein的阳性表达率为28.6%，Ⅲ、Ⅳ期患者γ-synuclein的阳性表达率为62.5%，差异有统计学意义 (P=0.009)，提示γ-synuclein的表达随TNM分期进展而升高;伴淋巴结转移的NSCLC患者中 γ-synuclein的阳性表达率为87.5%，不伴淋巴结转移的患者为19.4%，差异有统计学意义 (P=0.000)，提示γ-synuclein可能与NSCLC的预后有关，通过对 γ-synuclein的检测可以评价 NSCLC的预后。γ-synuclein的表达与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤的大小、病理类型，临床分型、有无胸腔积液及是否吸烟无关。

综上所述，γ-synuclein的表达与NSCLC的发生、分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关，但γ-synuclein能否成为NSCLC新的诊断标志及判断其预后的有效指标，还有待进一步研究。随着对γ-synuclein信号调控机制和功能研究的日渐深入，可能为NSCLC的基因治疗提供新的靶点和治疗措施。

1 Lavedan C，Leroy E，Dehejia A，et al.Identification，localization，and characterzation of the human γ-Synuclein gene〔J〕.Hum Genet，1998;103(1):106-12.

2 Lu A，Gupta A，Li C，et al.Molecular mechanisms for aberrant expression of the human breast cancer specific gene 1in breast cancer cells:control of transcription by DNA methylation and intronic sequences〔J〕.Oncogene，2001;20(17):5173-85.

3 Ji H，Liu YE，Jia T，et al.Identification of a breast cancer-specific gene，BCSGl，by direct differential cDNA sequencing〔J〕.Cancer Res，1997;57(4):759-64.

4 张惠卿，张宇新，张作凤，等.γ-Synuclein在乳腺癌中的表达及意义〔J〕. 中国肿瘤临床，2005;32(1):9-12.

5 Zhou CQ，Liu S，Xue LY，et al.Down-regulation of oc-Synuclein in human esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2003;9(9):1900-3.

6 Liu H，Liu W，Wu Y，et al.Loss of epigenetic control of synuclein-gamma gene as a molecular indicator of metastasis in a wide range of human cancers〔J〕.Cancer Res，2005;65(17):7635-43.