I型小肽载体的结构及活性调控研究进展

河北农业大学动物科技学院 梁陈冲 陈宝江＊ 李绍华

蛋白质吸收代谢机制一直是动物营养研究的重点，传统蛋白质理论认为蛋白质只有被降解成游离氨基酸才能够被机体吸收代谢。当Ⅰ型小肽载体（PepT1）在肠道被成功克隆后，小肽能被小肠吸收的观点才逐渐被广泛地接受。韩非等（2003）报道，动物体内已发现的小肽转运载体包括 PepT1、PepT2、PTR3、 大鼠的肽/组氨酸转运载体（PHT1）和人的肽/组氨酸转运载体（hPHT），其中研究最广泛的是PepT1。小肠对小肽的吸收是通过位于小肠上皮细胞刷状缘膜的H+耦合的肽转运载体（PepT1）进行的，而质子是作为肽转运的驱动力发挥作用的。迄今为止，PepT1是唯一被克隆的小肠肽转运载体，已经分别从人类、鼠、家兔、绵羊、鸡、猪和结肠癌细胞Caco-2中克隆出该载体蛋白 （Klang 等，2005；Chen 等，2002a、b；Pan等 ，2001；Walker 等 ，1998；Liang 等 ，1995；Satio等，1995；Boll等，1994）。

1 PepT1分子结构特征

目前对小肽转运载体的基因和蛋白质结构的研究证明，兔子、大鼠、绵羊、奶牛、鸡、猪和人的小肠 PepT1 mRNA 长分别为 2.9、2.9 ～ 3.0、2.8、2.8、2.9、3.5、3.3 kb （Pan 等，2001；Miyamote 等，1996；Liang等，1995；Fei等，1994）。 对 PepT1 分子结构的研究表明，不同动物的PepT1氨基酸序列长度存有差别，其中鸡的序列最长，为714个残基（Chen 等，2002a、b），牛和兔的最短，为 707 个残基（Fei等，1994），但分子质量均为 79 kD，分子结构也相同，都有12个跨膜区域，并在9和10两个跨膜区之间有一个较大的细胞外环，这也是转运蛋白最显著的特征；12个跨膜区域的氨基酸序列是高度保守的，但是细胞外环的氨基酸保守性较低，在细胞内环上有蛋白酶激酶C（PKC）和蛋白激酶A （PKA）的磷酸化作用位点；PepT1上的His-57和PepT2上的His-87是最关键的组氨酸残基，他们可能是转运蛋白发挥吸收功能时最关键的结合位点；不同动物肽转运蛋白的氨基酸为707～729个，且不同动物相同器官肽转运载体的同源性高，同种动物不同器官肽转运载体的同源性低（韩非等，2003）。

2 PepT1组织分布

虽然不同动物PepT1的组织分布不同，但所有动物小肠都有PepT1表达，而在肌肉、心脏则未曾检出PepT1 mRNA的存在，其他部位的表达情况则不同动物有所不同。Chen等（1999）研究表明，鸡在小肠、盲肠、肾脏都有PepT1分布，嗉囊、腺胃和肝脏不存在；Fei等（1994）报道，兔除了小肠有PepT1的表达以外，在肾脏、肝脏和大脑也有少量存在，但胃和盲肠没有表达；大鼠在肾脏有微量表达，肝脏中无表达；绵羊和奶牛的小肠、瓣胃和瘤胃有PepT1的表达，在真胃、肝脏、肾脏、盲肠和结肠中未检测到。

Chen等（1999）报道，从PepT1在肠道的表达强度来看，不同动物也存在差异，鸡主要以十二指肠为主，猪以空肠为主，反刍动物则以空肠和回肠为主。假设以mRNA丰度来表示小肠不同部位转运蛋白的含量，那么可以认为在小肠各部位的转运蛋白活性具有一定差异，这种种属之间的差异可以反映出蛋白质消化部位和对小肽的利用程度。

3 PepT1的活性调控

PepT1是一类低亲和力/高容量的肽载体，研究表明，底物、激素、生长因子、酶、饲粮营养水平和饲养管理等因素都能在一定程度上对其活性起到调控作用。

3.1 底物的调控 Pan等（2001）认为，PepT1对底物分子具有广泛的适应性，几乎可以转运所有的二肽和三肽。此外，PepT1还可以转运多肽类衍生物，其中包括β-内酰胺抗生素、血管紧张素转化酶抑制剂、凝血酶抑制剂和类二肽抗癌药物及多种药物前体物。但体外细胞培养实验发现肽载体对底物也有一定的选择性，可以选择转运不同分子结构的底物。

小肽的转运与底物的浓度也有关系，底物浓度高时转运量较大。Erickson等（1995）在小鼠试验中发现，高蛋白质（50%）日粮组小肠中段和远端PepT1 mRNA丰度比低蛋白质（4%）日粮组高1.5～2倍。Shiraga等（1999）试验也表明，在小鼠标准日粮中添加二肽（Gly-Phe），能增加PepT1基因表达。Chen等（2005）在鸡的试验中使用不同的饲粮蛋白质水平 （CP含量分别为12%、18%和24%），并保证各处理采食量相同，结果显示，随着蛋白质采食的增加，小肠中PepT1 mRNA丰度增加（P＜0.05），且在不同的组织中存在差异，空肠中PepT1 mRNA丰度高于十二指肠和回肠（P＜0.05）。可见，高蛋白质日粮增加了肠道中二肽、三肽和氨基酸的浓度，这些产物作为PepT1基因表达的信号因子，增加小肠刷状缘膜上的肽转运蛋白的水平，而最终使肽转运增加。

Chen 等（2002b）进行的[3H]-Gly-Sar吸收的抑制试验表明，二肽和三肽能明显抑制[3H]-Gly-San的吸收，这说明这些小肽可能作用于相同的转运位点，相互竞争，而该转运载体对游离的氨基酸及四肽以上寡肽不进行吸收，因而对[3H]-Gly-Sar的吸收无抑制作用。施用辉等（1996）向来航公鸡十二指肠灌注小肽的试验结果表明，肠道吸收底物中小肽所占的比例是影响吸收速度的重要元素，小肽比例越高氨基酸吸收越快。孙炳伟等（2003）采用头孢氨苄作为研究底物，Caco2细胞作为小肠上皮细胞模型，比较重组人生长激素对正常和缺氧复氧损伤后Caco2细胞PepT1功能的影响和调控作用，发现缺氧复氧损伤后，Caco-2细胞间隙增大，其特有的紧密连接结构被破坏；二肽载体的mRNA数量明显降低；对头孢氨苄的摄取量大大减少。

3.2 激素的调控

3.2.1 胰岛素对PepT1的调节 胰岛素被认为是代谢调控的一个重要因素，尤其对肌肉中葡萄糖和氨基酸的转运调控。Nielsen等（2003）报道，胰岛素短期刺激能增加Caco-2细胞摄取Gly-Ser的能力，但其上调作用与PepT1基因表达和质子驱动力无关。Meredith和Boyd（2000）早期关于胰岛素调控肽转运的报道表明，胰岛素通过增加肽载体的数量刺激肽的吸收，这种数量的增加是胞浆池中转运蛋白的转移造成的。Thamotharan等（1999）试验表明，在Caco-2细胞系培养基中添加生理浓度（5 nmol/L）的胰岛素，培养1 h，能显著增加小肠刷状缘膜上二肽的转运，其作用主要是通过胰岛素与位于小肠基底膜上的受体结合，如果破坏胰岛素与其受体的结合，胰岛素的作用消失。从动力学参数进行分析，胰岛素对PepT1转运二肽 （Gly-Gln）的Km值没有显著影响，但Vmax提高2倍，表明胰岛素不能提高PepT1对底物的转运活性，但能提高刷状缘膜上PepT1的浓度。膜上PepT1数量增加的机制表明，当破坏对重新合成PepT1转运起重要作用的高尔基体，胰岛素的作用仍然存在；进一步研究发现，胰岛素处理对肠黏膜上PepT1基因水平没有显著影响，说明胰岛素不能提高PepT1的合成，但如果破坏了对已合成PepT1转运起重要作用的微管，胰岛素的作用则消失。

3.2.2 甲状腺激素对PepT1的调节 甲状腺激素是由甲状腺分泌的，维持动物正常的生长发育、正常的体温和正常的能量水平，它的大多数作用是通过激活细胞核受体而进行调节的，导致mRNA和蛋白质合成的增加。Ashid等（2002）研究发现，T3会明显减少Caco-2细胞对[14C]Gly-Sar吸收的Vmax，且不影响Km值，PepT1及PepT1 mRNA的水平下降，表明甲状腺素抑制肽的转运可能是降低PepT1 mRNA的转录水平或影响其稳定性。

3.2.3 瘦素对PepT1的调节 随着瘦素的发现，对瘦素在肽吸收方面的调控作用也有了一些报道。Buyse等（2001）在Caco-2细胞系培养基中加入2 nmol/L瘦素，培养30 min，结果表明，瘦素能增加刷状缘膜上Gly-Sar的转运，对基底膜上二肽的转运没有影响；其PepT1转运动力学参数Vmax上升，Km保持不变，同时增加细胞膜上PepT1含量，降低胞内PepT1含量，但PepT1 mRNA水平没有改变。可见，瘦素对PepT1的调节机制和胰岛素相同，都是通过增加PepT1从细胞质到小肠刷状缘膜的转运，而不是增加其mRNA的表达来对膜上PepT1水平进行调节。

3.2.4 表皮生长因子对PepT1的调节 表皮生长因子（EGF）刺激表皮细胞和其他多种上皮和非上皮细胞的增殖，调节胃肠道分化与发育。其主要有两种不同的方式对PepT1进行调节，一种是长期作用，一种是短期作用。Nielsen等（2001）发现，EGF长期培养 （26～28 d）Caco-2细胞能够降低Gly-Sar转运量50%左右，Vmax降低90%，Km保持不变，同时PepT1mRNA表达水平和细胞膜PepT1蛋白表达量都明显降低，表明EGF是通过下调PepT1基因表达降低细胞二肽转运能力的。而Nielsen等（2003）的另一次研究发现，EGF刺激5 min即能增加Caco-2细胞摄取Gly-Ser的能力，并于10～20 min后达到平台期，Vmax提高了50%左右，Km不变，但并未影响PepT1 mRNA丰度和H+浓度，同时其促转运作用未受蛋白转运抑制剂的影响，表明EGF处理不会影响PepT1蛋白的合成。

总的来说，短期调节激素主要是通过影响PepT1在细胞内和膜上的分布来调节膜上PepT1的浓度，而长期调节激素主要是通过影响PepT1 mRNA水平 （影响转录或其半衰期）来影响膜上PepT1的表达。

3.3 蛋白激酶C和环化腺苷酸对PepT1的调节在PepT1结构中有一个蛋白激酶C位点（PKC，Ser-3 5 7）和cAMP依赖性磷酸化位点（PKA，Thr-362）。 Brandsch 等（1994）报道，用佛波醇处理Caco-2激活蛋白激酶C（PKC）明显抑制二肽转运，该抑制作用是特异性的，可被蛋白激酶抑制剂staurosporine阻断，其抑制作用与载体最大转运速率减低有关，并不改变其亲和力和质子驱动力，而蛋白质合成抑制剂放线菌酮对该效应无影响。Chen等（2002a）用staurosporine抑制PKC活性则明显增加PepT1肽载体对[3H]-Gly-Sar的转运，这种增加效应可被佛波醇12-豆蔻酸-13-醋酸酯（PMA、PKC激活剂）阻断，蛋白质合成抑制剂放线菌酮对该效应也无影响。Muller等（1996）用霍乱毒素、腺苷酸环化酶激活剂、大肠杆菌内毒素、磷酸二酯酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤处理细胞，提高Caco-2细胞内cAMP水平，抑制细胞对Gly-Sar的吸收，而霍乱毒素抑制作用也可被蛋白激酶抑制剂staurosporine、PKA抑制剂H-89和PKC抑制剂Chelerythrine所阻断。

3.4 营养和饲养管理对PepT1的调节 研究发现，小肠体内和体外对二肽的吸收随日粮蛋白水平和肽水平的提高而增加。Shiraga等（1999）用鼠作为动物模型就日粮中蛋白质水平对肠道中PepT1表达量的影响进行研究发现，50%酪蛋白组鼠肠道中PepT1 mRNA的表达量高于20%酪蛋白组，Gly-Phe二肽饲料组鼠肠道中PepT1 mRNA的表达量高于无蛋白质饲料组，但没有达到显著水平。Chen等（2005）研究了日粮蛋白质水平和限制饲喂对生长肉鸡肠道中PepT1 mRNA表达量的影响发现，限制采食的3个处理中，肠道PepT1 mRNA表达量的高低与蛋白质水平呈正相关。 Erickson（1995）用低蛋白质日粮（4%）和高蛋白质日粮（50%）饲养大鼠，结果表明，饲喂高蛋白日粮组的大鼠，其小肠中段和末段增加的PepT1mRNA是低蛋白质日粮组的1.5～2倍。

在畜禽饲养中，短期缺食是很常见的。研究发现，饥饿也能通过增加PepT1 mRNA和蛋白表达水平，促进小肽的摄入。Ihara等（2000）通过对采食量的控制，研究大鼠在营养不良条件下，小肠PepT1基因表达作用，结果表明，短期缺食可使肠道中PepT1 mRNA和蛋白的表达上调。Ferraris等（1998）报道，无论是短暂的还是长时间的饥饿，都会增加PepT1 mRNA水平，从而增加小肠黏膜刷状PepT1数量。从生理上讲，饥饿使得小肠吸收面积减少，而靠增加小肽载体的数量来弥补。在营养不良条件下，体脂和糖原作为能量贮备而被利用，由于蛋白质是组织结构的组成部分和生物活性物质，在体内并没有贮存库，蛋白质的损失或缺乏将导致生理功能的迅速下降。因此，在营养不良条件下PepT1 mRNA表达上调可能是一种适应性机制。在日粮供给后，使机体能迅速吸收小肽，假如这种上调机制出现迟缓，那么必需营养物质通过小肠吸收效率将会大大降低，导致动物生产性能显著下降。

3.5 其他 Pan等（2002）研究发现，昼夜节律也可影响肽转运蛋白的表达和活性，小肠PepT1 mRNA丰度和转运蛋白含量在 16∶00～24∶00比较高，在24∶00对[14C]Gly-Sar的吸收率显著高于12∶00。 但 Pan 等（2001）在对小鼠实行白天饲喂时，发现小肠黏膜中PepT1的昼夜变化规律与自由采食完全相反。可见，是采食变化引起PepT1的昼夜变化而不是光照的作用。另有报道PepT1转运活性与年龄有关，但各报道有所不一。Marion等（2001）研究表明，动物肥胖基因的产物Leptin可以使小肽转运蛋白对小肽的转运活性增强，表现为肠细胞内PepT1的含量减少，细胞膜上的含量增多，另外，体外吸收试验表明，Leptin可明显促进Caco-2细胞对二肽Gly-Sar的吸收。

4 研究PepT1的意义和存在的问题

小肽是日粮蛋白质在小肠中重要的消化产物。研究PepT1结构特点和调控方法，小肽在机体内消化吸收机理和转运过程，对了解小肽生理功能及对机体进行合理供应都具有重要的生物学意义。

尽管人们对PepT1有了一定研究，但这些大多集中在对不同种类动物PepT1结构及分布上，缺乏系统研究参与PepT1 mRNA及其表达蛋白活性调节因素的作用机制、如何利用这些调节因素提高蛋白质转运吸收以及小肽不同于游离氨基酸吸收利用的特点，而这些对于正确理解蛋白质营养、为动物配制平衡蛋白质日粮具有十分重要的理论和实践意义。

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