郭霍原则与16S rRNA基因序列分析在确定病原微生物中的应用

19世纪郭霍提出了关于某种微生物是否是病原的理论,这一理论后来被称为郭霍原则。郭霍原则包括以下3点[1-2]：1.某种微生物在某种疾病的所有病人中存在,包括那些有疑问的以及发生病理改变的病人。2.在其他疾病的病人中不能发现这种微生物。3.从病人中分离的微生物可以纯培养,并能引起同样的疾病。如果满足这3个条件,郭霍认为：“在某种疾病中出现的微生物不是偶然的,而是这种疾病的病原。”

郭霍原则源于他对结核分枝杆菌和炭疽芽孢杆菌的研究工作,其目的在于建立微生物与疾病之间关系的准则。通过这一准则可以为某种微生物是否致病提供依据,同时也可以促使微生物学家使用更加严格的标准来确定病原微生物。这一严格的标准构建了微生物和疾病之间关系的框架,对于某些疾病,如结核病,这一原则得到了很好的应用：郭霍在病人组织中观察到结核分枝杆菌;在体外获得纯培养;并在动物中复制出结核病的模型,而正常的动物和人的组织中没有发现结核分枝杆菌。但是即使是郭霍自己也很快认识到这一原则的局限性。郭霍认为霍乱和麻风是由某种特定的微生物引起的,但是他并不能完成郭霍原则的所有步骤。尽管霍乱弧菌可以从霍乱病人中分离到,但是在健康人中也可分离到霍乱弧菌;而麻风分枝杆菌并不能获得纯培养。从19世纪开始,人们认识到有很多新的病原-主要是病毒-不能获得纯培养,必须依靠其他的细胞才能复制;伴随着免疫学以及图像技术的发展,细菌性、真菌性以及蛋白类病原的病原谱也在不断的扩大。随着人类对病原微生物认识的深入,人们逐渐发现了郭霍原则的很多局限和问题,主要体现在以下几个方面：1.很多病原不能获得纯培养：许多明确的病原微生物如恶性疟原虫以及绝大多数病毒只有借助别的细胞才能培养。2.没有合适的动物模型来复制疾病：一些病原微生物如：HIV病毒,具有宿主局限性,不能在其他动物里面复制出典型的动物模型,因此从实验和伦理的角度都不可能完成郭霍原则的第三点。3.正常带菌者：脑膜炎奈瑟菌对某些个体能引起疾病,而对于其他个体来说仅仅是携带而无症状。4.病原微生物通过毒素致病,从病人身上分离不到病原菌或者是在病原消失后,通过刺激机体的免疫系统引起疾病：如葡萄球菌肠毒素引起的疾病和链球菌引起的超敏反应性疾病。5.通过共感染引起疾病或者是一种病毒依靠另外一种病毒才能致病：无毒的白喉棒状杆菌本身无外毒素基因,只有通过整合噬菌体上的外毒素基因才能致病。6.某种微生物只是引起机体免疫状态、生理状态或者基因的变异,而不直接导致疾病,等等。虽然存在着种种局限,但是郭霍原则的意义并不在于其过于严格应用,而是其衍生出的严格精神。对于病原的研究在于科学的证据,而郭霍原则是收集证据的纲领。

现在的知识告诉我们,感染是微生物在宿主体内的生活中与宿主相互作用并导致不同程度的病理变化的过程,是微生物与宿主在个体、细胞核分子多层面相互作用的生理学现象。即使定义为病原的微生物通常引起的也只是亚临床感染。比如大部分人接触到结核分枝杆菌之后并没有明显的症状,可能仅仅是某些实验,如结核菌素试验,为阳性。

郭霍时代之后生物医学上最具革命性的进步就是发现核酸是生命的基础。通过检测及操作核酸分子我们能够发现及鉴定未知的病原微生物,同时研究病原与宿主的相互关系。相对于病毒因其基因序列之间的巨大差异而找不到可以通用的基因标签,细菌中很多的基因标签都可以用于细菌鉴定。这些基因标签包括编码5S,16S以及23S rRNA的基因,以及这些基因的间隔区域[3-5],还有其他一些保守基因如编码延长因子G和质子转运ATP酶类的序列[6]等。在这些基因标签中16s rRNA基因由于其自身的优势成为应用最为广泛的微生物鉴定基因。首先16S rRNA基因全长约1 550 bp,包括多个保守和可变区域;有足够的种间多样性和有效的统计学意义,可以在保守区域设计引物扩增中间片段或者是全长,然后通过比对可变区域进行细菌鉴定和种系分析[7]。其次16S rRNA基因不仅可以对所有细菌进行种系研究,也可以与古细菌的16S rRNA基因以及真核生物的18S rRNA基因进行比较[8]。另外应用于16S rRNA基因序列比对的数据库有其优势。目前有多个数据库可以用来进行16S rRNA基因序列比对,包括公共数据库(GenBank),商业化数据库(MicroSeq)以及 SmartGene数据库等。最常用的是GenBank数据库,该数据库中有超过180万条16S rRNA基因序列(2010年3月的数据,这个数目还在不断的快速增长)。通过这些数据库人们可以有效的从数据库中比对出未知菌属的菌株[9]。同时数据库的发展与16S rRNA基因进行细菌鉴定的应用是相互促进的,随着数据库越来越大,16S rRNA基因序列也变的越来越吸引人。

应用16S rRNA基因鉴定新的细菌性病原已经有了多个成功的例子。

1 惠普尔病(Whipple's Disease)

1907年有了首例惠普尔病患者的报告,其临床症状为反复发作的关节炎及体重下降、咳嗽、发热、腹泻、低血压、腹部肿胀、皮肤色素沉着及重度贫血。尸检发现多浆膜炎、主动脉瓣病损及肠粘膜和肠系膜淋巴结脂肪沉积和泡沫状巨噬细胞的浸润[10]。

从报告这一疾病开始,就有证据证明惠普尔病是一种细菌性疾病[11-13]。一是通过电子显微镜可以从病人的感染组织中观察到一种杆菌。二是这种疾病抗生素治疗有效,且随着病情的好转该种微生物会在感染组织中消失;而如果病情复发的话,又会在感染组织中重新发现这种微生物。有两个不同实验室对可能的病原进行了研究[14-15]。在第一组的研究中,人们从病损组织中使用通用引物扩增了部分16S rRNA基因序列。通过分析得到的数据,研究者认为在这部分组织中有107个该种微生物,这一数值远远高于正常的上消化道组织中应有的细菌数。然而这一发现的特异性没有通过其他部位的阴性对照来证实。在这个研究中,显微镜观察到的结果和通过核酸扩增技术得到的结果实现了统一,人们认为发现的就是病原[15]。在第二组的研究中,人们得到了相似但是更加完整的16S rRNA基因序列,并且在10份阴性对照中没有扩增出对应16S rRNA基因序列。研究者使用了几对相互独立的通用引物进行16S rRNA基因的扩增,都得到了一致的特异性结果。根据其序列得到的种系发生树,以及该种疾病和病原特殊的临床及组织学特征,命名了一个新的种Tropheryma whippelii[14]。在这个研究中尽管病例数有限,但是数据满足了郭霍原则的头两条。而这一结果在以后对惠普尔病的研究中得到了证实[16-17]。

2 人埃立克体病(Human Ehrlichiosis)

在1986年,Maeda等报道一例51岁男子的病例,其临床表现为发热,头痛,抑郁和肌肉痛,同时伴有轻微的肝炎,急性肾衰,贫血和血小板减少[18]。最初这个病人被诊断为落矶山斑点热,氯霉素和强力霉素治疗有效。医生们发现病人的血清除了对犬埃里克体的抗体凝集外,对其他血清都不凝集;通过电子显微镜观察发现病人也有巨噬细胞包涵体,这与犬埃里克体病相似。这些结果证明,引起这种疾病的病因可能是犬埃里克体或者是与之相近的种属。从1987年到1993年,美国共有299例人埃里克体病的报道,其共同的特征是白细胞和血小板减少以及转氨酶的升高[19]。后来从一个病人的巨噬细胞中培养出类埃里克体的微生物[20]。使用通用引物对培养物以及两个病人的血标本进行了16S rRNA基因的扩增,通过对序列的分析发现人埃里克体病的病原是埃里克体属的一个新种,后被命名为查菲埃立克体(E.chaf f eensis),其与犬埃里克体亲缘关系很近。后来的研究也证明,犬埃里克体与查菲埃立克体的血清交叉凝集。在19例查菲埃立克体血清阳性的标本中使用特异性引物检出了查菲埃立克体的16S rRNA基因序列[21]。而第二个埃里克体的新种的发现也应用了16S rRNA基因序列分析方法。90年代初期,美国在多例急性发热病人的中性粒细胞胞质内发现埃立克体样包涵体。1995年,Goodman等从病人的血标本分离到该种嗜粒细胞病原体,并使用16S rRNA基因序列对其进行了种属研究,将它正式命名为人粒细胞埃立克体,其所致疾病称为人粒细胞埃立克体病[22]。后经16S rRNA基因序列的系统发生分析,发现该种嗜粒细胞病原体与无形体属种属关系最近,因此,将其归于无形体属的一个新种,命名为嗜吞噬细胞无形体,其所致疾病也改称为人粒细胞无形体病。

3 杆菌性血管瘤-杆菌性紫癜(bacillary angiomatosis-bacillary peliosis,BAP)

杆菌性上皮样血管瘤病亦称杆菌性血管瘤病或上皮样血管瘤病。1983年由 Stoler等首先报道[23],他们从一个艾滋病病人身上发现一种不同于Kaposi肉瘤的多发性皮肤血管增生性疾病,并在皮损中发现有小杆菌存在;他们认为这是一种新的可以引起皮肤和内脏小血管增生的感染性疾病。后来经研究证实杆菌性血管瘤病可以导致AIDS患者及免疫缺陷病人皮肤小血管的增生以及内脏器官的损伤,同时可以导致猫爪热。在病损组织中通过War-thin-Starry染色可以观察到小杆菌。研究者使用通用引物对病人组织提取的核酸直接进行16S rRNA基因的扩增,其中三个相互独立的病人的基因序列是完全一致的,第四个病人的序列也仅有很小的差别,而在正常组织中没有扩展出该片段。将这些序列与已知序列进行比较发现这是种病原属于新的病原,其种系发生关系上与立克次体最接近[24]。这一结果给该病原的培养提供了依据,而后来的培养结果证实这一病原为汉塞巴尔通体(Bartonella henselae)[25-26]。尽管还没有合适的动物模型,但是病原的培养促进了抗血清和免疫学诊断的发展,最终实现了该种疾病的诊断。

虽然应用16S rRNA基因方法鉴定新的微生物病原已经有了很多成功的应用,但是在实际工作中我们仍然要注意很多的问题。一是在使用16S rRNA基因方法鉴定新病原的时候首先必须确定该疾病是细菌性疾病,这需要染色、显微镜技术以及免疫学技术的应用;抗生素的疗效可能也会起提示作用。二是需要判断得到的序列与疾病的关系。疾病通常是一个复杂而长期的过程,在疾病的某个时期从病人某个病损部位中得到的序列信息或者是并没有扩增出有意义的序列,可能并不能真实的反映微生物和疾病的关系。人们通过16S rRNA基因分析可以获得某种微生物的信息,但是16S rRNA基因并不是编码毒力基因的序列,所以得到这个序列并不意味着这种微生物一定致病。另外仅仅得到的序列信息而没有纯化的微生物,就不可能实现郭霍原则的第三点,也就不能严格的建立该种微生物和疾病的关系。三是使用通用引物对临床标本特别是不能严格无菌的标本进行扩增的时候通常得到的是一组16S rRNA基因信息;而引起疾病的通常只是其中的某个克隆。如何在这一组数据中挑选出有意义的克隆?有研究称从以前认为是严格无菌的部位扩增出16S rRNA基因,虽然这些结果需要进一步的确认,但是这也给16S rRNA基因方法的使用提出了挑战[27-28]。而对于那些本来就不能严格无菌的标本即使有平行对照其结果的解释也需要更加慎重。

16S rRNA基因鉴定病原的实验方法本身也有其缺陷。其中最主要的问题在于PCR方法的高敏感性所带来的污染问题。即使采取了最严格的技术手段去防止污染,使用针对保守基因设计的引物仍然可以在大多数临床标本中扩增出序列,这是因为无法避免的临床标本以及PCR试剂中的污染,这种污染甚至包括了Tag酶[29-30]。而在使用16S rRNA基因的通用引物对临床标本进行扩增的时候,这种污染的情况更容易出现。在我们的实验中也发现在使用某些Tag酶产品的时候会出现假阳性的结果,这可能是由于Tag酶的生产过程中纯化不完全造成的。另外一个值得注意的问题是应用于16S rRNA基因序列比对的数据库。作为最常用的公共数据库GenBank,其中虽然有大量的16S rRNA基因序列,但是这些序列并没有经过筛选。Wilck等人[31]认为虽然GenBank数据库内容广泛,其包括了人源,动物源和环境中的致病以及非致病菌的信息,但是其序列并没有经过有效的评价,其质量不高。他们认为临床实验室在使用16S rRNA基因在进行菌种鉴定的时候一定要对数据库中的相应序列进行评价,这样才能保证结果的准确。

综上所述,郭霍原则虽然为病原鉴定方法奠定了坚实的基础,但是随着人们对疾病认识的深入,郭霍原则的缺陷也突显出来。随着核酸技术的发展,基于核酸序列的病原鉴定方法给人们提供了更多的帮助。相对于传统的病原鉴定方法基于序列的病原鉴定方法在鉴定非培养的微生物或难培养微生物上有很大的优势,同时序列信息更加客观和精确。在某些情况下,序列信息虽然不能确定病原,但是可以给疾病的诊断和治疗提供帮助,为了解病原特性和病原分离提供线索。但是在使用基于序列的病原鉴定方法的时候也应该注意到方法自身的问题和局限,同时由于疾病本身的复杂性和长期性,对于序列的结果的解释也要慎重。

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