重组人血白蛋白的研究进展

温中华 朱 海 戴小宇 张晓冬*

（1 第二军医大学生物技术系，上海 200433；2 第二军医大学药物安全性评价中心，上海 200433）

人血白蛋白（Human serum albumin，HSA）是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，约占到血浆蛋白总量的60%。HSA能维持血液动力学平衡和血管内渗透压，吸收组织中多余液体到血液循环中，使动脉压升高，广泛应用于失血创伤烧伤引起的休克，脑水肿及损伤引起的颅压升高，肝硬化及肾病引起的水肿或腹水，低蛋白血症的防治和新生儿高胆红素血症等。目前临床使用的HSA制品绝大部分部是从人源血浆中提取纯化而得（Plasma-derived HSA，pdHSA），来源有限，价格昂贵，还不能排除病毒（特别是艾滋病病毒和乙肝病毒）或其他潜在致病因子的影响，这都极大限制着HSA的广泛应用。而重组人血白蛋白（Recombinant human serum albumin，rHSA）则可以避免病毒感染，到目前为止，已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、植物和转基因动物等系统中进行了rHSA的表达研究，通过基因改造或化学修饰还能进一步扩大rHSA的临床应用范围，是目前研究的热点。

1 rHSA与pdHSA的比较

1.1 结构比较

高度纯化的rHSA与pdHSA在分子结构上完全一致，是一条66.5-kDa单链、非糖基化多肽链，由585个氨基酸残基组成，富含组氨酸和色氨酸，含17对二硫键和一个半胱氨酸位点。rHSA的三级结构呈心形，67%为α-螺旋，不含β-折叠，由三个结构域（（I、Ⅱ和Ⅲ）组成，每个结构域又各包含两个亚结构域。Sadaharu等[1]分析了rHSA的三个结构域与药物的结合能力，发现I型区域与药物结合的能力最强，这是由其34位上游离的半胱氨酸残基所决定的。

1.2 功能比较

rHSA作为pdHSA可能的临床替代品，具有与pdHSA相似的生理功能。大鼠体内静脉注射用同位素125I标记rHSA与pdHSA，发现二者在组织分布、血液半衰期以及尿液和粪便代谢方面都无显著差异[2]。一、二、三期临床试验结果表明rHSA具有较好的疗效，不良反应较小[3]。在结合和转运内外源性物质方面，rHSA对药物如华法林、苯丙香豆素、普拉洛芬、布洛芬等的立体选择性结合特性与pdHSA一致[2]。需要注意的是，HSA在用于治疗出血性休克、烧伤、白蛋白过少等病症时，由于在病理条件下毛细血管对HSA的通透性增加，大量输入HSA后可能会透过毛细血管壁而导致器官水肿，肺脏对此尤为敏感，从而使病情加重。通过基因工程手段获得的rHSA二聚体在保留相应的生理功能不变的情况下，既延长了其血浆半衰期，又降低了其毛细血管通过率，将有可能解决这一问题[4]。

1.3 安全性比较

pdHSA由于其可能含有血源捐赠者自身所携带的病毒（如艾滋病病毒、肝炎病毒等）和其他潜在的致病因子，使得患者在使用pdHSA制品时将面临巨大风险。而影响rHSA安全应用于临床的主要潜在危险因素是其所含有的极少量酵母成分，包括蛋白质和甘露聚糖等多糖成分，这些成分可能会在重复注输时导致急性免疫反应，从而危害患者健康。因此，提高rHSA的分离纯化技术，尽可能减少杂质含量，将有助于提高rHSA的安全性。

2 rHSA的临床研究现状

临床前研究结果显示在分子结构、理化性质以及免疫学等方面rHSA与pdHSA相似，针对rHSA安全性和疗效的一、二、三期临床试验也已在世界许多实验室和临床中心相继开展。

一期临床实验主要是对rHSA进行初步的临床药理学及人体安全性评价。在日本进行的一期临床实验中，25名健康志愿者连续三天静脉注射rHSA后，检测的生理指标（如血压、脉搏、体质量、心电图检测、血液和尿液分析等）未发现药物相关明显异常，并且在3个月内rHSA抗体滴度无显著升高[3]。英国DELTA公司一期临床试验将rHSA与pdHSA在安全性、耐受性、药理学以及药代动力学等方面做了对比，结果表明二者在这些方面具有相似性[5]。

二期临床试验进一步验证rHSA的有效性和安全性，考察其不良反应。对出血性休克、肝硬化和肝腹水患者的治疗结果证实rHSA具有极好的疗效，且不良反应极小[3]。Kazushi[6]等还研究了rHSA在治疗患肾病综合症的儿童患者中的效果，6名肾病综合症儿童患者在接受连有髓袢利尿剂的rHSA（0.3～0.5 g/kg）的治疗后，没有产生严重的不良反应。

在扩大的多中心临床试验中，423名肝硬化患者经过间隔2周的三个周期重复给予rHSA，每个周期持续3d。结果显示血清蛋白水平和胶体渗透压均显著升高。423名患者中有96名出现不良反应（22.7%），但均没有严重的过敏反应，而且三个周期之间的不良反应发生率没有明显不同[7]。在其他三期临床试验中，rHSA在治疗如烧伤、肾病综合症、出血性休克、急性腹部不适以及直接心脏外科手术中的高危患者等，也都表现出较好的疗效。

3 rHSA的研究趋势

3.1 融合蛋白

许多蛋白类或多肽药物在血液中清除速率较快，临床上不得不提高剂量或用药次数，以稳定疗效，在一定程度上增加了药物的不良反应以及患者的医药负担。通过基因重组，将药物蛋白或多肽的基因与人血白蛋白的基因融合表达，获得的融合蛋白不仅可以保留原药物蛋白生物活性，还提高了稳定性，延长其半衰期，并有可能增强其靶向性，提高疗效。

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是一种分泌型糖蛋白，能有效促进粒细胞、巨噬细胞的分化增生。通过细菌表达的重组粒细胞集落刺激因子（rG-CSF）已经应用于临床，如用于治疗患肿瘤放疗、化疗引起的粒细胞减少症、再生障碍性贫血等。但由于其半衰期短，为维持最佳疗效需要频繁给药。通过基因重组，可将rG-CSF的N-末端与rHSA的C-末端连接形成融合蛋白。Halpern等[8]研究了重组人粒细胞集落刺激因子白蛋白融合蛋白在小鼠和食蟹猴体内的药效学和药动学特点。两种动物上融合蛋白与非融合型比较半衰期、平均滞留时间和清除率均显著延长。

Osborn等[9]将人白细胞介素-2（IL-2）基因与HSA基因融合，表达获得融合蛋白Albuleukin。Albuleukin将IL-2的血浆半衰期从19-57min延长到了6-8h，其在促进淋巴细胞增殖、受体结合、和诱导NK细胞分泌IFN-γ等方面表现出与rIL-2相似的特点。二者都能有效抑制小鼠肾细胞腺瘤和肝黑色素瘤，并且Albuleukin在预防转移和改善生存率上比rIL-2更有效。其他的研究还有胸腺素-α1（Tα1）和四苯基卟啉等，融合蛋白均显示出与原来相似的药效学特性[10,11]。

3.2 药物载体

rHSA另外一个重要医学用途是作为一种新型药物载体，能有效提高药物输送的靶向性和代谢半衰期，这对于不良反应大、机体容易产生耐药性的药物来说是一个新的选择。rHSA作为药物载体有两种途径，其一是形成类似脂质体的微囊，包裹着药物运送到体内；另一途径则是通过化学修饰等方法直接与相应药物连接进行运输。

白蛋白微囊按其直径大小不同经静脉注射入体内后可有效输送到肺部或肝脏。15～30 um或更大直径的微球体可在流经心脏后99%沉积于肺部的毛细血管床；而1～3um大小的微球体则可以通过网状内皮组织90%沉积在肝脏。因此白蛋白微球体可用作药物载体进行靶向输送，以减少用药剂量，减轻不良反应[3]。

rHSA通过化学修饰或基因改造后，还可获得与特定细胞表面受体相结合的配体基团，从而进行体内靶向输送。糖蛋白很容易识别相应细胞受体，经甘露糖修饰后的人血清白蛋白能有效识别肝脏Kupffer细胞表面甘露糖受体。Kenshiro等[12]成功设计并通过基因工程手段表达出甘露糖化重组人血清白蛋白的三聚体（TM-rHSA），TM-rHSA能识别肝脏非实质细胞上的甘露糖受体，从而被选择性的运送到肝脏。Masaaki等[13]在室温下通过二硫键的断裂使rHSA部分变性进而连接成水凝胶体，并对水凝胶与苯甲酸钠、水杨酸和华法林等药物的结合和释放能力进行了实验，发现水凝胶化后的rHSA仍保留有对药物的结合能力。其将苯甲酸钠和水杨酸完全释放需要2h，而华法林则持续约24h。这表明rHSA水凝胶具有持续稳定释放药物的能力，可作为一种新型药物控释载体。

将抗肿瘤化疗药物与血蛋白相结合是目前研究的热点，紫杉醇白蛋白纳米混悬液于2008年6月在我国批准上市，临床上已得到了广泛的应用。Naohisa等[14]研究发现，对于将LY-80移植到大鼠右肢形成的肿瘤，直接进行肿瘤注射硫基一氧化氮-重组人血白蛋白（S-nitrosylated human serum albumin，SNO-HSA），肿瘤生长受到明显抑制。

用rHSA输送药物的一个重要好处是能有效提高机体对相应药物的耐受性，即便是对于机体已经产生耐受的药物，将其与rHSA联合后在再次输入体内时，仍然可能具有一定疗效。例如在临床上有些肾病综合症患者由于对利尿剂产生耐受而进一步发展成严重水肿、胸腔积液和腹水时，对其注射已结合了髓袢利尿剂的rHSA将会产生较好的疗效[15]。

4 展 望

应用现代基因工程技术获得高纯度的rHSA在结构、功能和免疫学性质等方面pdHSA基本相似，有望成为pdHSA替代产品，日本田ā三菱制药株式会社研制的基因重组人血白蛋白于2008年全球首次上市，用于治疗由于烧伤、肝硬化等引起的白蛋白严重丢失等症。但由于其在临床中使用剂量大，极其微量的百分比不纯物质，在单一剂量中就是微克甚至毫克级的，所以要求的纯度要更高，因此对rHSA的研究提出了更高的要求，在安全性、功能，以及患者对其认知接受程度上还有许多工作要做。而通过基因工程手段获得rHSA与其他重要蛋白的融合蛋白，或经化学修饰与药物结合，使之成为重要的药物运送载体也是其未来发展的重要方面。

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