蛋白质组学样品处理方法研究进展

卢国栋，张克山，刘永杰，尚佑军，郭建宏，郑海学，田 宏，刘湘涛

（中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室，甘肃 兰州 730046）

1994年澳大利亚学者 Wilkins和 Williams等人[1]提出了蛋白质组（ Proteome）的概念，随后蛋白质组学[2]应运而生且应用广泛。蛋白质组学研究对象包括动物、植物和微生物，样品的来源广泛且复杂。蛋白质的表达具有时间和空间的特异性，蛋白质数量可能是其基因数量的数十倍甚至百倍以上[3]。所以对蛋白质的分析将是后基因组时代面临的巨大挑战[4]。1975年O’Farrel等[5]建立的双向凝胶电泳技术和80年代末 John B.Fenn[6]和 Koichi Tanaka[7]发明的质谱分析方法极大的推动了蛋白质组学的发展，已成为目前该领域主要的研究技术手段。但双向凝胶电泳分析和质谱鉴定对样品的溶解度、纯度和浓度等要求较高，简单处理的蛋白质样品无法满足需要。为了达到有效的蛋白质分离、显色和鉴定，蛋白质的前处理至关重要。本文从对疏水性强的蛋白质[8]、极性蛋白质、高丰度蛋白的处理、低丰度蛋白的富集和对样品溶液中干扰性物质的去除以及对不同染色后质谱前处理等方面综述了蛋白质样品的一般处理方法。

1 双向凝胶电泳蛋白质样品处理

双向凝胶电泳技术伴随着蛋白质组学的起始和发展，样品处理是否得当直接影响双向电泳的效果[9]。样品处理的目的是破坏蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用产生独立的多肽链，提高样品的溶解度，保持蛋白质样品在整个电泳过程中的溶解状态，防止蛋白质的人为修饰。此外，蛋白质样品处理过程中去除了蛋白酶、核酸、糖类、脂类和盐类等非蛋白质杂质，减少了对后期蛋白质的分离、显色和质谱鉴定产生的影响。

1.1 不溶性蛋白质的处理

天然状态的蛋白质溶解度一般较低，蛋白质的增溶作用影响着最终结果并且决定着整个实验成败。由于蛋白质的异原性和非蛋白类杂质的影响，使所有的蛋白质同时溶解仍具有很大的挑战性。对于不同样品，需要摸索与之最相适应的处理手段。目前增加蛋白质溶解性的原理是加入试剂破坏蛋白质多聚体内部的相互作用力包括二硫键、氢键、范德华力、离子键和疏水键等，使蛋白质多聚体裂解为单个的多肽而具有强的溶解性，这些试剂包括离液剂（尿素和硫脲），去污剂（CHAPS和 triton-100），还原剂（DTT，TBP）和蛋白酶抑制剂等[10]。

尿素是一种中性的离液剂，浓度为5～9 mol/L的尿素可以有效破坏蛋白质的二级结构使蛋白质展开并暴露出可电离的结构群体使之溶解性增强。实验证明，尿素溶液中加入硫脲会进一步增加一些水溶性蛋白和跨膜蛋白的溶解度[11]，当尿素中加入了2 mol/L的硫脲，尿素的浓度不应该超过5～7 mol/L[12]。但硫脲会阻碍蛋白质与SDS的结合，因此在进行第二向电泳之前应去除该试剂[13]，值得注意的是尿素和硫脲在温度较高时可分别水解成氰酸盐和硫氰酸盐，导致蛋白质人为的修饰，所以样品温度不要超过37℃，同时尿素缓冲液中加入两性电解质载体可以清除氰酸盐[10]。目前提高与膜脂质形成复合物的膜相关蛋白的溶解度是当今蛋白质组学研究中样品处理的最大挑战，去污剂对膜蛋白复合物的提取是极其重要的。去污剂分为离子型（SDS）、非离子型（TritonX-100）和两性离子型（CHAPS和ASB-14），去污剂的浓度范围一般为1%～4%。离子型去污剂对疏水性蛋白质和膜蛋白的增溶作用效果较好，但干扰非变性电泳和等电聚焦，为不影响SDS-PAGE，最好选用两性离子和非离子去污剂。两性离子去污剂结合了其他类型去污剂的优点，能够有效的分解蛋白质多聚体，增溶作用更佳[14]。Triton和NP40，十二烷基麦芽苷[15]等非变性的不带电荷的去污剂是现在蛋白质组学广泛使用的去污剂，能够保证蛋白质的溶解并且不会发生凝集作用。同时，Taylor和Pfeiffer也发现非离子N-十二烷基-β-D-麦芽苷和两性离子 ASB-14能够比单用CHAPS更有效的溶解髓磷脂蛋白质类[16]。另外，烷基磺酸甜菜碱如SB3-10也已得到应用，缺点是它在高浓度的尿素溶液中溶解度很低[17]。研究表明，在等点聚焦过程中，还原剂可极大的增加角蛋白的溶解度，通常应用巯基还原剂（DTT、DTE），浓度一般在20～100mmol/L。DTT具有不和4-乙烯吡啶、丙烯酰胺发生作用的优点而广泛应用[18]。

在蛋白质组学研究中，蛋白酶的存在会使多种蛋白质发生酶解。Rawlings等人研究表明，人类的机体内含有700种蛋白酶[19]。所以细胞裂解之后或分离时需加入特定的蛋白酶抑制剂，如:PMSF，AEBSF，EDTA，抑肽素，苄脒等。除此之外，在进行小量蛋白样品提取时，SDS缓冲液经煮沸后加入高pH值的tris碱同样可以达到抑制蛋白酶的作用[20]。在酸性的预冷的溶液中（比如20%的TCA）和高浓度的尿素溶液中[13]可以将蛋白酶的降解作用降到最小。另有研究表明，热休克蛋白在体外可以抑制蛋白酶的作用保护蛋白不被酶解[21]。

1.2 可溶性蛋白质的前处理

不可溶性蛋白质经过处理溶解度增加成为可溶性蛋白质，但是，样品中还有很多其它干扰物质，如实验中处理用的缓冲液、盐类、脂质、糖类、核酸和去污剂等都会阻碍蛋白质分离，显色，鉴定等步骤，使数据分析复杂化，必需将其除去。

蛋白样品中的盐类组分可使蛋白质发生沉淀和聚集，在双向凝胶电泳前应予以除盐。一般通过超滤，透析，TCA沉淀，凝胶过滤或者有机溶剂和固相萃取等方法经行除盐，另外也可用商品化的试剂盒进行除盐。Yuan等对上述除盐方法进行了比较发现[22]:相比透析法，超滤法的吸附主要发生在过滤器上，可以减少蛋白量的损失。柱子去盐法的优点是具有蛋白复性的功能。现已有商业化微离心过滤装置用来除去污染物。脂质物质广泛存在于生物的机体内，并和许多蛋白质结合形成复合物，造成蛋白质的溶解度降低，甚至影响等电点和分子量。另外，脂质还会影响到去污剂的作用并降低蛋白质富集和分离效应。所以在双向凝胶电泳的样品前处理中经常运用离心过滤装置或含有CHAPS的样品缓冲液去除脂质，实现蛋白复性和高效率的分离[23]。另外，蛋白质样品中存在的多聚糖和核酸与两性电解质反应并堵塞聚丙烯酰胺胶上的小孔，易发生蛋白沉淀或者使聚焦时间延长而使双向电泳胶上出现纹理。在银染时，会使胶的背景产生拖尾。为了从样品中除去多聚糖和核酸，TCA、丙酮苯或酚/醋酸铵沉淀法是很有效的方法。当多聚糖含量较高时，可用超速离心法除去。去污剂的去除包括透析，凝胶过滤层析，疏水吸附层析和蛋白沉淀。对于一些临界胶束浓度高或者聚合数量少的去污剂，常选用层析法。对样品中广谱的去污剂，选用凝胶过滤，但会导致样品一定程度的稀释。相对来说，离子交换层析可有效地去除非离子和两性去污剂。此外，SDS可以用纳米级亲水相层析或丙酮沉淀去除，在-20℃时效果比室温要好。对于两性去污剂的去除，凝胶过滤层析和去污剂亲和层析效果相当，略优于透析。同样，SPE（固相萃取）在稀释的蛋白溶液中去除CHAPS很有效，比标准的透析或凝胶过滤层析有更好的效果。

1.3 高丰度蛋白的去除和低丰度蛋白的富集

高丰度蛋白会影响到低丰度蛋白的聚焦，降低了装载容量，从而掩盖了双向图谱中一些重要的蛋白位点，丢失了重要的信息；相反，很多低丰度蛋白质在生物机体内发挥着非常重要的作用，在蛋白样品中含量却很低，所以在电泳前必须进行高丰度蛋白的去处和低丰度蛋白的富集。血浆，血清和脑脊液是很重要的蛋白质组研究对象，这些样品中往往90%的蛋白是高丰度蛋白，如白蛋白，免疫球蛋白等。这些高丰度蛋白影响到分子量相似的低丰度蛋白的检测[24]。如今，很多公司都开发出去除高丰度蛋白的试剂盒，如BIO-RAD Aurum Serum Proteinmini Kit试剂盒等。另外，Merrick等[25]在研究肝损伤后血清中蛋白质变化的实验中运用基于蛋白A/G的抗体亲和柱成功的去除了血清中高丰度蛋白。

丙酮、TCA、异丙醇、硫酸铵、乙醇、氯仿/甲醇，聚乙烯乙二醇（PEG）或亲和层析试剂是常用的蛋白质富集试剂。另外，免疫沉淀反应也可以应用到蛋白质的富集中，其原理是抗体和抗原结合反应，能够选择性地富集一种或一类具有相似抗原的蛋白质[26]。蛋白质富集最简单的方法是超速离心法。亚细胞器的分离是利用该混合物的密度特征通过一系列不同的速度离心，或者用蔗糖/甘露醇梯度分离进行富集[27]，如线粒体，膜蛋白，核蛋白或其它亚结构蛋白质的富集都是通过此种方法实现。Wenkui等人在研究叶酸缺乏引发的肝脏和脑的病变时也通过密度梯度离心法分离了蛋白质样品[28]。另外，层析分离可根据蛋白质的电荷，疏水性，大小或特异性来分离纯化和富集蛋白质。

1.4 极性蛋白质的处理

双向凝胶电泳技术在分离极性蛋白时面临一定的挑战[29]，大部分双向凝胶电泳分离到的蛋白质的等电点分布在4～8之间，但是也有一部分蛋白质的等电点大于8[30]，而且在有些蛋白质组学研究中极性蛋白居多。通过比较再水化上样和杯上样两种上样方式可以发现，再水化上样对宽pH范围和酸性pH范围的胶条分离效果好[31]。但是在进行碱性蛋白质的分离时再水化上样却不再适合，研究表明杯上样方式能明显减少蛋白沉淀，提高碱性蛋白的聚焦效果[32]。另外在毛细管电泳分离中发现，加入10%的异丙醇可以降低EOF（电渗流驱动）效应达40%，利用这种原理，在再水化液中加入异丙醇可以提高2-DE在碱性区蛋白质的分辨率。此外，由于局部温度升高会造成凝胶介质磨擦力加大，导致蛋白质在胶条上沉淀，甘油则能使胶条柔性增加，减低了这种效果，也使聚焦效果更好[33]。另外，等电聚焦过程中，再水化液中提高DTT浓度和IPG缓冲液的浓度能增加蛋白的溶解性[34]。实验表明，将再水化液中DTT的浓度由常规的0.2%提高到2.5%，IPG缓冲液浓度由0.5%提高到2%，可提高pH6～9胶条碱性端蛋白的聚焦效果。

2 质谱鉴定前蛋白质样品处理

胶内蛋白点（带）在进行质谱鉴定前需先脱色。银染脱色一般使用30mmol/L铁氰化钾与100mmol/L硫代硫酸钠等比例混合溶液；考染脱色一般使用含50mmol/L碳酸氢铵的50%乙腈水溶液。胶内蛋白质处于变性状态，在质谱鉴定前需还原蛋白质。试验证明，经含10mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的100mmol/L碳酸氢铵溶液处理后可较好的还原蛋白质。蛋白质还原后还需经过几步处理包括:含有55mmol/L碘乙酰胺（IAA）的100mmol/L碳酸氢铵溶液暗处处理30min；100mmol/L的碳酸氢铵溶液，室温处理15min；100%ACN室温震荡5min后吸去，冻干；冻干后加入Trypsin溶液，置于4℃30～60min，使胶块充分吸胀，移走过量的胰酶溶液；再加入50mmol/L的碳酸氢铵溶液，使胶块在酶解过程中保持浸润；吸出酶解缓冲液，加入含有0.1%TFA的60%乙腈水溶液，超声15min，吸出溶液并入前次溶液，重复一次，溶液冻干。

3 展望

综上所述，蛋白质组学样品处理可从两方面分析，一是双向凝胶电泳蛋白样品处理；二是质谱蛋白样品处理。双向凝胶电泳主要进行可溶性蛋白的分离[35]，所以处理方法的改进可以提高样品的溶解度，去除非蛋白类杂质的干扰，最大程度还原样品的真实状态，增加试验结果的可靠性。质谱技术用于鉴定蛋白样品，对蛋白质的纯度要求较高[36]，样品处理后可达到鉴定的敏感性和可靠性。

由于蛋白质数量多、化学结构和性质各异、样品组分复杂，经过近30多年的发展蛋白质组学仍处于初级阶段，样品处理至今没有统一的标准[13]。一些特殊蛋白质，如膜蛋白，极性蛋白，高分子量和低分子量蛋白等还有待进一步的研究。此外，细胞器内蛋白质、磷脂肽、糖化蛋白等与信号通路相关的蛋白质[37]，将会成为研究的热点，势必会对蛋白质组学样品处理技术提出新挑战。随着蛋白质组学样品处理技术的突破性发展，将会推动双向凝胶电泳分离技术和质谱鉴定技术在蛋白质组学中发挥更显著的作用。

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