昆虫与哺乳动物蛋白质 N-糖基化修饰异同的比较及其潜在的应用意义

韦亚东 牛淼淼 刘子瑜 车凤玉 张国政

(1江苏科技大学,江苏镇江 212018; 2中国农业科学院蚕业研究所,江苏镇江 212018)

昆虫与哺乳动物蛋白质 N-糖基化修饰异同的比较及其潜在的应用意义

韦亚东1,2牛淼淼1刘子瑜1车凤玉1张国政1,2

(1江苏科技大学,江苏镇江 212018;2中国农业科学院蚕业研究所,江苏镇江 212018)

基于过去多年来所积累的关于昆虫蛋白质糖基化修饰的研究成果,对昆虫与哺乳动物的蛋白质 N-糖基化修饰途径与分子机制的异同进行了比较分析,同时进一步讨论如何在人们前期研究的基础上,对昆虫杆状病毒表达系统的蛋白质糖基化修饰途径做些改造性工作,以期能够直接利用该昆虫杆状病毒表达系统生产人源化糖蛋白。

昆虫;哺乳动物;杆状病毒;表达系统;N-糖基化修饰;人源化糖蛋白

自 20世纪 80年代以来,人们对昆虫杆状病毒表达系统进行了全面的研究并表达了大量的重组蛋白［1］。该表达系统包括作为表达载体的重组病毒和作为病毒繁殖宿主的昆虫细胞或虫体,外源基因的表达是利用重组病毒非常强的病毒晚期基因启动子,如 polyhedrin或 p10等,协同病毒转录复合体完成的［2］。基于该表达系统除了能够以非常高的水平表达外源基因外,还能够容纳很大的外源基因的插入表达,是一个很好的表达多亚基功能蛋白的平台［3］。同时,对人或动物具有相对的生物安全性。因此,人们逐渐把它作为基因治疗及应用该系统将外源基因引入哺乳动物细胞或组织的重要工具［4］。

在昆虫杆状病毒表达中,当病毒载体进入宿主细胞,宿主自身的基因表达基本上全面停止,细胞内的蛋白质合成系统转向合成表达病毒基因,包括插入的外源基因。作为杆状病毒宿主的昆虫是真核生物,细胞能够以多种复杂的方式对合成的蛋白质进行后修饰,表达的重组蛋白在细胞内被折叠、修饰、运输组装成最终的功能蛋白［5］。其中,N-糖基化是蛋白质翻译后修饰中非常重要的一种,与蛋白质的正确折叠、生物半衰期及生物功能正常发挥息息相关。目前的研究结果表明,昆虫的糖基化修饰和高等动物的不同［6］。哺乳动物的糖蛋白是具有唾液酸末端的杂合型 N-糖链构型,而昆虫细胞表达的糖蛋白糖链具有非常简单的侧链,是低甘露糖型,并且含有对人类具有过敏反应［7］的核心 α-1,3连接的岩藻糖。这些糖链结构的差异,极大地限制了昆虫杆状病毒表达系统在人类医药上的应用。因此,正确认识、分析比较昆虫与哺乳动物的蛋白质 N-糖基化修饰途径及其分子机制的不同,对改造昆虫杆状病毒表达系统糖基化修饰途径,表达人源化糖蛋白具有非常重要的必要性。本文对昆虫与哺乳动物蛋白质 N-糖基化修饰途径中的糖链修饰的起始、核心糖链剪接加工、侧链岩藻糖化、核心糖链分枝与延长及其分子机制异同进行比较分析如下。

1 昆虫和哺乳动物糖蛋白的 N-糖链修饰的起始及核心糖链剪接加工的差异

真核生物的蛋白质糖基化修饰过程通常在内质网和高尔基体内进行的。初始阶段,事先在一系列酶的作用下组装好的寡糖复合前体,转运到新生肽的糖基化保守序列的氨基酸上。随后的初始糖链在糖苷酶的作用下进行糖链的剪切和在糖基转运酶作用下的糖链加工,形成了一个小的糖链核心结构。在不同的物种中,这个糖链核心结构能够通过不同的后续途径,进一步分枝和延长成最终的成熟糖蛋白的带有侧链的寡糖糖链。N-糖链修饰的起始及核心糖链的形成,在昆虫和哺乳动物细胞内的途径是基本一致和相似的［8］。

研究比较清楚的哺乳动物的蛋白质糖基化过程是起始于寡糖转运酶的作用。寡糖转运酶是存在于内质网中的一个多亚基的蛋白酶,它将事先组装好的 Glc3Man9GlcNAc2寡糖,从寡糖载运脂体转运至新生肽的糖基化识别位点(Asn-X-Thr/Ser)上［9］。紧接着内质网膜上的 α-葡萄糖苷酶 I,将最外末端的 α-1,2连接的葡萄糖去除掉［10］。另外的内质网膜上的 α-葡萄糖苷酶 II去除掉第 2个 α-1,3连接的葡萄糖,形成剩有 1个葡萄糖的核心 GlcMan9Glc-NAc2［11］,这个酶的后继作用将最后剩下的 α-1,3连接的葡萄糖从 GlcMan9GlcNAc2上去除掉,形成保守的高甘露糖型的 N-糖链构型Man9GlcNAc2。这个结构的糖链既可能是某些糖蛋白的最终糖链构型,也可能是某些糖蛋白糖链形成的中间物。

随后糖链 Man9GlcNAc2中甘露糖的剪切加工,是在位于内质网和高尔基体内分属于 Class I和Class II的 α-甘露糖苷酶作用下进行的［12］。α-甘露糖苷酶的协同作用从 Man9GlcNAc2上去除掉所有 4个 α-1,2甘露糖,最终形成非常重要的中间核心体Man5GlcNAc2。这个作用过程包括 2个内质网 α-甘露糖苷酶 I和 α-甘露糖苷酶 II及 3个高尔基体内的 α-甘露糖苷酶 IA、α-甘露糖苷酶 IB及 α-甘露糖苷酶 IC［13］。内质网 α-甘露糖苷酶 I是一个作用比较慢的酶,其只能专一性地去除中间支链的末端甘露糖,形成 Man8GlcNAc2异构体 B。同样,内质网 α-甘露糖苷酶 II也只能从 Man9GlcNAc2上去除掉一个末端的 α-1,3支链的甘露糖,最终形成 Man8Glc-NAc2异构体 C［14］。紧接着的 3个α-1,2连接的甘露糖分别被高尔基体 Class I的 3个 α-甘露糖苷酶去除掉,他们分别有自己特殊的底物构型偏好。

Man5GlcNAc2是蛋白质 N-糖基化修饰过程中非常重要的核心糖。在不同物种中,该核心糖在高尔基体的一些糖苷酶作用下,最终形成具有物种特性的高甘露糖构型、杂合型或复合型构型［15］。杂合构型的 N-糖链的末端 α-1,3连接的甘露糖被N-乙酰氨基葡糖代替,但保留 α-1,6连接的甘露糖。复合构型的 N-糖链的 2个 α-1,3连接的甘露糖和 α-1,6连接的甘露糖均被 N-乙酰氨基葡糖所代替。

昆虫的蛋白质 N-糖基化修饰的起始和哺乳动物类似,就是一同将寡糖前体物从 Glc3Man9Glc-NAc2-PP-Dol转移到新生肽链的 N-糖基化位点的天冬酰胺上［7］。这个结论已经被昆虫细胞中的 N-糖链和脂质体连在一起所证实［16］。昆虫和哺乳动物细胞内从 Glc3Man9GlcNAc2去除掉末端的葡萄糖的途径也是一致的,但昆虫体内编码 α-葡萄糖苷酶 I和 α-葡萄糖苷酶 II的基因还没有被克隆出来,不过通过酶抑制剂［17］和 N-糖链的分析［18］,能够证实鳞翅目昆虫细胞存在这 2个酶的活性。另外,在鳞翅目昆虫中也已证实了与甘露糖剪切加工相关的 α-甘露糖苷酶存在［19］。

2 昆虫和哺乳动物中糖蛋白 N-糖链岩藻糖化的异同

昆虫和哺乳动物体内都存在核心 α-1,6岩藻糖转运酶,这个酶可以在连接天冬酰胺的 GlcNAcMan3GlcNAc2的 N-乙酰氨基葡糖残基上,加上 α-1,6连接的岩藻糖。昆虫的糖基化进程随后在 Class II甘露糖苷酶的剪接加工和核心 α-1,6岩藻糖化后,就与哺乳动物彻底不同了［20］。

特殊的是,昆虫细胞内的岩藻糖转运酶能够将共同中间体 GlcNAcMan3GlcNAc(α1,6Fuc)GlcNAc,修饰成一个核心 α-1,3岩藻糖化的 N-糖链［21］。这个核心 α-1,3岩藻糖转运酶严格需要核心α-1,6岩藻糖转运酶的优先作用［22］,并且已经知道其产物的N-糖链对哺乳动物产生过敏反应［23］。另一个重要的不同是有些昆虫细胞具有膜锚定的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性,这种酶活性在线虫［24］和一些植物［25］中也有发现。它能够特异地从 GlcNAcMan3GlcNAc(±α1,3/6Fuc)GlcNAc移除末端的 N-乙酰氨基葡糖残基［26］。因此,昆虫的主要 N-糖链产物Man3GlcNAc(±α1,3/6Fuc)GlcNAc一般被叫做低甘露糖构型,这些低甘露糖构型的N-糖链不能进一步延长。

3 昆虫和哺乳动物糖蛋白的核心糖链分枝与延长

在哺乳动物细胞内,Man5GlcNAc2转化为 N-糖链的杂合型或复合型结构是由高尔基 N-乙酰氨基葡糖转运酶 I(GlcNAc-TI)起始的,它把 1个N-乙酰氨基葡糖残基,以 β-1,2键转运到 α-1,3支链的甘露糖上,形成 GlcNAcMan5GlcNAc。这个中间体可以以很多途径转化为杂合构型,其中 N-乙酰氨基葡糖转运酶 III(GlcNAc-TIII)就可以在单酶的情况下,将该中间体最终转变为杂合型的糖链。这个酶能够在中间的 β-1,2连接的甘露糖上添加 1个 N-乙酰氨基葡糖,阻断了随后的高尔基 α-甘露糖苷酶 II的作用［27］。正常情况下,高尔基 α-甘露糖苷酶 II完成最后的甘露糖修剪作用,去除 GlcNAcMan5GlcNAc2上的 α-1,2和 α-1,6连接的甘露糖残基,生成中间体GlcNAcMan3GlcNAc2［28］。高尔基 α-甘露糖苷酶II的作用要求必须优先在 Man5GLcNAc2的 α-1,3支链上,用 GlcNAc-TI加上 1个 N-乙酰氨基葡糖残基。

在 GlcNAcMan5GlcNAc2的 α-1,3支链上,优先加上 N-乙酰氨基葡糖,也是 α-1,6海藻糖转运酶形成核心海藻糖化的前体条件,它是转运 1个α-1,6连接的海藻糖残基到直接和天冬酰胺连接的 N-乙酰氨基葡糖上［29］。所以,海藻糖化的核心 GlcNAc-Man3GlcNAc(Fucα1,6)GlcNAc是通过 N-乙酰氨基葡糖转运酶 I、高尔基 α-甘露糖苷酶 II和核心 α-1,6海藻糖转运酶协同作用的结果。

另 1个高尔基 N-乙酰氨基葡糖转运酶 II(Glc-NAc-TII),通过在 GlcNAcMan3GlcNAc(±Fucα1,6)GlcNAc的末端 α-1,6连接的甘露糖上,添加β-1,2连接的 N-乙酰氨基葡糖,形成第 1个复合型的糖链［27］。高尔基 α-甘露糖苷酶 II和核心 α-1,6海藻糖转运酶一样,GlcNAc-TII也需要和 GlcNAc-TI一样的优先添加反应［30］。GlcNAc-TI和 GlcNAc-TII酶广泛存在于各种组织和细胞中,它们启动了 N-糖链的 2个支链的延伸,形成最终的双天线 N-糖链构型。另外的支链可以由 1个或多个 N-乙酰氨基葡糖转运酶启动,包括 GlcNAc-TIV、GlcNAc-TV和 GlcNAc-TVI。在这些酶的作用下,最终产生四、五或者六天线的 N-糖链,但它们多严格限制在某些组织或恶性肿瘤里。

有末端 N-乙酰氨基葡糖的 N-糖链能够被 1个或多个高尔基体 β-1,4半乳糖转运酶(β4GalTs)进一步延长,这至少需要 7种人基因编码的酶和各种特殊的受体底物［31］。其中 β4GalTI到 VI参与糖蛋白或糖脂的生物合成［32］,但 β4GalT-VII仅参与蛋白聚糖的生物合成［31］。

在哺乳动物细胞内,末端半乳糖化的糖链的都加上 α-2,3,α-2,6及 α-2,8连接的唾液酸。人类基因组上编码多于 20种不同的唾液酸转运酶,其中15种已经被克隆和研究［33］。这些唾液酸转运酶都是高尔基体的 II型转膜糖蛋白,具有 3个一致的 L、S和 VS区域［34］。不同的唾液酸转运酶作用不同的唾液酸连接键,并有不同的特殊受体底物。唾液酸化在很多生物过程中起重要的作用,如神经系统的发育、糖蛋白及红细胞循环的翻转、病原和宿主的相互作用和免疫系统功能等,它们还和恶性肿瘤的扩散及癌变有关系［35］。从药物应用角度来改造重组糖蛋白时,应该考虑到唾液酸化,因为它能够在哺乳动物细胞循环系统里,保护糖蛋白不被清除。这可以明显增加糖蛋白药物的药物代谢动力学和它的药物疗效［36］。

人们普遍认为昆虫没有末端糖链转运酶或者唾液酸代谢机制［37］,昆虫的 N-糖链形成途径被认为只能限制形成低甘露糖的糖链构型。但事实并非如此,现在一些生物化学的、组织化学的、结构学的及分子遗传学的证据表明,至少某些昆虫具有一些潜在的进一步延长末端唾液酸化糖蛋白的 N-糖链的能力。特别是近来果蝇基因组的生物信息学研究表明,昆虫具有很多哺乳动物 N-糖链分枝、延伸及唾液酸化的基因,并且这些基因产物潜在的生物化学功能已被实验证实［38］,只是这些基因的表达被严格限制于昆虫的一些特殊组织和发育状态［15］。

尽管某些昆虫、昆虫的某些组织或某些昆虫细胞具有潜在的产生哺乳动物的复合型末端唾液酸化的 N-糖链的能力,但目前在以 sf21、sf9和 BTI-Tn-5B1-4(High Five)及 Bm细胞作为宿主使用的昆虫杆状病毒表达系统中,表达的重组 N-糖蛋白的糖链是简单的、没有唾液酸化的低甘露糖型,而不是哺乳动物在相同糖基化位置产生的唾液酸化的复合型糖链。这使得昆虫杆状病毒表达系统实际上不可能期望能够生产出具有高等动物的 N-糖链的糖蛋白,极大地限制了昆虫杆状病毒表达系统在表达哺乳动物糖蛋白上的应用。

4 目前关于昆虫蛋白质 N-糖基化途径的观点

昆虫杆状病毒系统自建立以来,表达了包括糖蛋白在内的大量重组蛋白,提供了很多鳞翅目昆虫细胞的 N-糖基化途径的信息,也间接促进了昆虫蛋白质的 N-糖基化途径的生化和分子遗传学的研究。昆虫基因组项目的完成,尤其是果蝇基因组项目［39］和家蚕基因组项目［40］对我们理解认识昆虫蛋白质的 N-糖基化途径具有巨大的促进作用。

目前的观点是,哺乳动物和昆虫蛋白质糖基化途径的前半部分,包括 N-糖链的起始转运和核心糖链的剪切加工是相似或一样的,都产生一样的高甘露糖的核心糖链。这个共同的核心糖链,一是作为后续糖基化的中间体,随后修饰加工成 1个或 2个共同的中间产物 GlcNAcMan3GlcNAc［±Fuc］Glc-NAc,进入哺乳动物和昆虫不同的后半部分。二是直接作为一些糖蛋白的某些糖基化位点上寡糖链的最终产物。在哺乳动物和昆虫细胞蛋白质糖基化的后半部分,N-糖链的中间体延伸加工过程及掺入的修饰酶均不同。哺乳动物的蛋白质 N-糖链延长加工成常见的双天线复合型结构,而昆虫细胞的蛋白质 N-糖链为低甘露糖结构,含有核心 α-1,3岩藻糖,有时末端 N-乙酰葡糖胺会被 GlcNAcase移除。其中产生的核心 α-1,3岩藻糖会在人体内引起过敏反应。

实际上,在昆虫蛋白质的糖基化修饰过程中,最终的 N-糖链的形成有时决定于很多不同的因子。其中一个明显的因子就是糖蛋白产物自身的自然属性,其蛋白质本身及其糖链加工修饰的一系列产物是否为相应糖基修饰酶的较好底物,会影响和决定随后的加工途径及最终糖链构型。另一方面,编码这些糖基修饰酶基因的不同表达水平及其下游调控作用,也会明显地影响蛋白质 N-糖链的最终构型。

5 昆虫蛋白质 N-糖基化途径改造

尽管昆虫自身具有优化 N-糖基化进程的潜能,使蛋白质修饰的糖链类似哺乳动物,但目前的昆虫杆状病毒系统还不能表达出具有哺乳动物糖链构型的重组糖蛋白。利用改变昆虫细胞的培养液配方组成或改造病毒载体及昆虫细胞株,是生产具有哺乳动物糖链构型糖蛋白的可以探索的新研究方向。比较有效可行的方法是利用基因改造的方法,对昆虫杆状病毒表达系统的宿主细胞系,进行糖基化途径改造,引入哺乳动物的一些相关糖基修饰酶基因,人为地改变昆虫的糖基化途径。技术层面上,可以通过将相关糖基修饰酶利用杆状病毒引入昆虫宿主细胞或者直接基因改造昆虫宿主细胞,达到改造昆虫糖基化修饰途径的目的,但引入的糖基化修饰基因表达的时间非常重要。这要求引入的糖基修饰酶的表达,要比所要表达的重组糖蛋白在时间上提前的多,才能保证表达的目的重组糖蛋白的糖基化按设计好的途径进行。

目前一些文献报道,用转染和双筛选方法,将编码和表达哺乳动物的 β1,4GalT(Sfβ4GalT［41］)、α-2,6sialyltransferase(Sfβ4Gal/ST6［42］和 Tnβ4Gal/ST6［43］)、 GlcNAc-T、 GlcNAc-TII、 β-1,4 GalT、 α-2,6sialyltransferase及 α-2,3sialyltransferase(SfSWT-1［44］)基因插入昆虫细胞sf9及 BTI-Tn-5B1-4(High Five)中得到亚细胞株。这些新细胞株的生长特性和它们的母系相似,当杆状病毒感染该细胞亚株表达外源糖蛋白时,蛋白质上的糖链延长为类似哺乳动物的双天线复合型末端单唾液酸化的糖链结构［44］。

通常昆虫细胞系 (如Sf9)不具有 sialyltransferase酶活性的底物 CMP-sialic acid,这种物质是糖链唾液酸化所必需的［45］。但细胞亚株 SfSWT-1可以在含有外加唾液酸的培养基中,使表达的糖蛋白的糖链唾液酸化,表明这些昆虫细胞具有补偿型营养途径［46］。随后人们将编码唾液酸合成酶和 CMP-唾液酸合成酶的哺乳动物基因,插入 SfSWT-1细胞内,得到的 SfSWT-3细胞株,就能够在细胞内合成CMP-唾液酸,形成的糖链为双天线、末端单唾液酸化的复合型 N-糖链［47］。

6 小结和展望

到目前为止,昆虫杆状病毒表达系统已经被广泛地用来表达各种各样的重组糖蛋白,对这些糖蛋白的研究,直接或间接地拓展了我们对昆虫系统的N-糖基化途径的理解。但由于昆虫杆状病毒表达系统,不能像哺乳动物细胞一样产生双天线的复合型唾液酸化的糖链,而使其在应用上受到限制。尽管昆虫细胞内也部分地具有和 N-糖链最后修饰相关的哺乳动物同类糖链修饰酶的表达,但这些酶被严格地限制于某些昆虫、昆虫某些组织类型或某些不知道的环境因素所控制的某些昆虫发育阶段。另外,某些昆虫细胞株(如 Trichoplusia ni)所表达的重组糖蛋白糖链具有核心 α-1,3连接的岩藻糖,在人体中会引起过敏反应。这些昆虫非复合型唾液酸化糖链和具有核心 α-1,3连接的岩藻糖修饰都易引起人类过敏反应,限制了昆虫杆状病毒表达系统在医药上的应用。需要发展新的能够替代的病毒宿主、宿主生长环境条件或转基因的病毒宿主等系统,其具备产生哺乳动物糖链的能力。同时,还需要进一步将病毒宿主内不需要的 GlcNAcase及核心α-1,3连接的岩藻糖转运酶活性去除掉。然后,所有的对该系统改进的工作,都需要利用该系统大量表达重组糖蛋白,分析其糖链的变化,来检测该系统的糖基化能力。这样经过改造的新的昆虫杆状表达系统,就能够用于生产医药应用的糖蛋白,尤其是能够直接用于体内治疗应用的糖蛋白,更好地为人类应用。

［1］O'Reilly D R,Miller L K,Luckow V A.Baculovirus expression vectors［M］.New York:W H Freeman and Company,1992:112-132.

［2］Lu A,Miller L K.In The Baculoviruses［M］.New York:Plenum Press,1997:193-216.

［3］Berger I,Fitzgerald D J,Richmond T J.Baculovirus expression system for heterologousmultiprotein complexes［J］.Nat Biotechnol,2004,(22):1 583-1 587.

［4］Kost T A,Condreay JP.Recombinantbaculovirusesasmammalian cell gene-delivery vectors［J］.Tr Biotechnol,2002,(20):173-180.

［5］Jarvis D L.In The Baculoviruses［M］.New York:Plenum Press,1997:389-431.

［6］Harrison R L,Jarvis D L.In Insect Viruses:Biotechnological Applications［M］.New York:Plenum Press,2006:109-210.

［7］Marz L,Altmann F,Staudacher E,et al.In Glycoproteins［M］.Amsterdam:Elsevier,1995:543-563.

［8］Kornfeld R,Kornfeld S.Post-translational protein modification in the endoplasmic reticulum.Demonstration of fatty acylase and deoxymannojirimycin-sensitive alpha-mannosidase activities［J］.Ann Rev Biochem,1985,(54):631-664.

［9］Burda P,Aebi M.The dolichol pathway of N-linked glycosylation［J］.Biochim Biophys Acta,1999,(1 426):239-257.

［10］Kalz-Fuller B,Bieberich E,Bause E.Cloning and expression of glucosidase I from human hippocampus［J］.Eur J Biochem,1995,(231):344-351.

［11］Arendt CW,Ostergaard H L.Identification of the CD 45-associated 116-kDa and 80-kDaproteinsas thealpha-and beta-subunitsof alpha-glucosidase II［J］.JBiol Chem,1997,(272):13 117-13 125.

［12］Moremen K W,Trimble R G,Herscovics A.Glycosidases of the asparagine-linked oligosaccharide processing pathway［J］.Glycobiology,1994,(4):113-125.

［13］Herscovics A.Structure and function of Class Ialpha 1,2-mannosidases involved in glycoprotein synthesis and endoplasmic reticulum quality control［J］.Biochimie,2001,(83):757-762.

［14］Weng S,Spiro R G.Demonstration that a kifunensine-resistant alpha-mannosidase with a unique processing action on N-linked oligosaccharides occurs in rat liver endoplasm ic reticulum and various cultured cells［J］.JBiol Chem,1993,(268):25 656-25 663.

［15］Schachter H.In G lycoproteins［M］.Amsterdam:Elsevier,1995:153-199.

［16］Parker G F,Williams P J,Butters T D,et al.Major orthopaedic surgery on the leg and thromboembolism［J］.FEBS Lett,1991,(290):58-60.

［17］Marchal I,Mir A M,Km iecik D,et al.Use of inhibitors to characterize intermediates in theprocessing of N-glycans synthesized by insect cells:ametabolic study with Sf9 cell line［J］.Glycobiology,1999,(9):645-654.

［18］Ailor E,Takahashi N,Tsukamoto Y,et al.N-glycan patterns of human transferrin produced in Trichoplusia ni insect cells:effects of mammalian galactosyltransferase［J］.Glycobiology,2000,(10):837-847.

［19］Davidson D J,Bretthauer R K,Castellino F J.alpha-Mannosidase-catalyzed trimming of high-mannose glycans in noninfected and baculovirus-infected Spodoptera frugiperda cells(IPLB-SF-21AE).A possible contributing regulatorymechanism for assembly of complex-type oligosaccharides in infected cells［J］.Biochemistry,1991,(30):9 811-9 815.

［20］Shi X,Jarvis D L.Protein N-glycosylation in the baculovirus-insect cell system［J］.Curr Drug Targets,2007,8(10):1 116-1 125.

［21］Fabini G,Freilinger A,Altmann F,et al.Identification of core alpha 1,3-fucosylated glycansand c loning of the requisite fucosyltransferase cDNA from Drosophilamelanogaster.Potential basis of the neural anti-horseadish peroxidase epitope［J］.J Biol Chem,2001,(276):28 058-28 067.

［22］Staudacher E,Marz L.Strict order of(Fuc to Asn-linked Glc-NAc)fucosyltransferases forming core-difucosylated structures［J］.Glycoconj J,1998,(15):355-360.

［23］Bencurova M,Hemmer W,Focke-Tejkl M,et al.Specificity of IgG and IgE antibodies against plant and insect glycoprotein glycans determined with artificial glycoforms of human transferrin［J］.Glycobiology,2004,(14):457-466.

［24］ZhangW,Cao P,Chen S,etal.Synthesisof paucimannoseN-glycans by Caenorhabditiselegans requires prior actionsofUDP-N-acetyl-D-glucosamine:alpha-3-D-mannoside beta1,2-N-acetylglucosaminyltransferase I,alpha3,6-mannosidase II and a specific membrane-bound beta-N-acetylglucosam inidase［J］.Biochem J,2003,(372):53-64.

［25］Vitale A,ChrispeelsM J.Transient N-acetylglucosamine in thebi-osynthesis of phytohemagglutinin:attachment in the Golgi apparatusand removal in protein bodies［J］.JCell Biol,1984,(99):133-140.

［26］Altmann F,SchwihlaH,Staudacher E,et al.Insect cells contain an unusual,membrane-bound beta-N-acetylglucosaminidase probably involved in the processing of protein N-glycans［J］.JBiol Chem,1995,(270):17 344-17 349.

［27］Xia Q,Guo Y,Zhang Z,et al.Complete resequencing of 40 genomes reveals domestication events and genes in silkworm(Bombyx)［J］.Science,2009,(5 951):433-436.

［28］Trimble R B,Moremen KW,Herscovics A.In Guidebook to the Secretory Pathway［M］.Oxford:Sambrook and Tooze Scientific Publishers,1992:185-189.

［29］Wilson JR,Williams D,Schachter H.The control of glycoprotein synthesis:N-acetylglucosamine linkage to a mannose residue as a signal for the attachment of L-fucose to the asparagine-linked N-acetylglucosam ine residue of glycopeptide from alpha1-acid glycoprotein［J］.Biochem Biophys Res Commun,1976,(72):909-916.

［30］Bendiak B,Schachter H.Control of glycoprotein synthesis.Kineticmechanism,substrate specificity,and inhibition characteristics of UDP-N-acetylglucosamine:alpha-D-mannoside beta 1-2 N-acetylglucosaminyltransferase II from rat liver［J］.JBiol Chem,1987,(262):5 784-5 790.

［31］Almeida R,Levery SB,Mandel U,et al.Cloning and expression of a proteoglycan UDP-galactose:beta-xylose beta1,4-galactosyltransferase I.A seventhmember of the human beta4-galactosyltransferase gene fam ily［J］.J Biol Chem,1999,(274):26 165-26 171.

［32］Sato T,Furukawa K,Bakker H,et al.Differences in N-acetyllactosamine synthesisbetween beta-1,4-galactosyltransferases Iand V［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,1998,(95):472-477.

［33］Harduin-Lepers A,Vallejo-Ruiz V,Krzewinski-Recchi M A,et al.The human sialyltransferase fam ily［J］.Biochim ie,2001,(83):727-737.

［34］Datta A K,Paulson JC.The sialyltransferase“sialylmotif” participates in binding the donor substrate CMP-NeuAc［J］.J Biol Chem,1995,(270):1 497-1 500.

［35］Schauer R.Achievements and challenges of sialic acid research［J］.Glycoconj J,2000,(17):485-499.

［36］VarkiA.Biological rolesof oligosaccharides:all of the theoriesare correct［J］.Glycobiology,1993,(3):97-130.

［37］Hsieh P,Robbins PW.Regulation of asparagine-linked oligosaccharide processing.Oligosaccharideprocessing in Aedesalbopictus mosquito cells［J］.JBiol Chem,1984,(259):2 375-2 382.

［38］Tsitilou S G,Grammenoudi S.Evidence for alternative splicing and developmental regulation of the Drosophilamelanogaster Mgat2(N-acetylglucosam inyltransferase II)gene［J］.Biochem Biophys Res Comm,2003,(312):1 372-1 376.

［39］Kim K,Lawrence SM,Park J,et al.Expression of a functional Drosophilamelanogaster N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac)phosphate synthase gene:evidence for endogenous sialic acid biosynthetic ability in insects［J］.Glycobiology,2002,(12):73-83.

［40］Adams M D,Celniker S E,Holt R A,et al.The genome sequence of Drosophilamelanogaster［J］.Science,2000,(287):2 185-2 195.

［41］Hollister JR,Shaper JH,Jarvis D L.Stable expression ofmammalian beta 1,4-galactosyltransferase extends the N-glycosylation pathway in insectcells［J］.Glycobiology,1998,(8):473-480.

［42］Hollister JR,Jarvis D L.Engineering lepidopteran insect cells for sialoglycoprotein production by genetic transformation with mammalian beta 1,4-galactosyltransferase and alpha 2,6-sialyltransferase genes［J］.Glycobiology,2001,(11):1-9.

［43］Breitbach K,JarvisD L.Improved glycosylation of a foreign protein by Tn-5B 1-4 cells engineered to expressmammalian glycosyltransferases［J］.Biotechnol Bioengr,2001,(74):230-239.

［44］Hollister JR,Grabenhorst E,Nimtz M,et al.Engineering the protein N-glycosylation pathway in insect cells for production ofbiantennary,complex N-glycans［J］.Biochem istry,2002,(41):15 093-15 104.

［45］Tomiya N,Ailor E,Lawrence SM,et al.Determination of nucleotides and sugar nucleotides involved in protein glycosylation by high-performance anion-exchange chromatography:sugar nucleotide contents in cultured insect cells and mammalian cells［J］.Analyt Biochem,2001,(293):129-137.

［46］Hollister JR,Conradt H O,Jarvis D L.Evidence for a sialic acid salvaging pathway in lepidopteran insect cells［J］.Glycobiology,2003,(13):487-495.

［47］Aum iller J J,Hollister JR,Jarvis D L.A transgenic insect cell line engineered to produce CMP-sialic acid and sialylated glycoproteins［J］.Glycobiology,2003,(13):497-507.

S881.2

B

1007-0982(2011)02-0008-06

2010-12-01;

2011-03-03

韦亚东(1969—),男,山东莒南,博士,副研究员。

Tel:0511-85616587,E-mail:yadongww@yahoo.com