10味中药对畜禽大肠杆菌的体外抗菌活性试验

郎利敏，王克领，张立宪，张青娴，游 弋

（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州农业路1号450002）

大肠杆菌可引起多种畜禽疫病，临床最常见的有仔猪黄、白痢，仔猪水肿病，鸡的败血症、心包炎、肝周炎、腹膜炎、肠炎，家兔的黏液性肠炎等[1]。大肠杆菌病目前在国内大多数养殖场广泛流行，发病率和死亡率居高不下，严重威胁着畜禽养殖业的发展，给养殖业造成了巨大的经济损失。目前，临床上主要还是使用抗生素药物来控制大肠杆菌病，由于广泛、大量、长期不规范的使用抗生素而导致大肠杆菌的耐药性越来越严重，防治效果越来越差，并导致药物残留和一些药源性疾病，严重威胁着动物源性食品安全和公共卫生[2]。而一些中草药具有抗菌、消炎、不易产生耐药性、低毒、低残留、可提高机体免疫力、来源广泛等特点，受到了广泛的关注，也开展了一些研究工作[3、4]。为了全面了解中草药对多种畜禽大肠杆菌的抗菌效果，笔者选用10味中药单方对从患病猪、鸡、兔病料中分离鉴定的大肠杆菌进行了体外抗菌试验，旨在了解这些中药的抗菌效果，为防治该病的临床用药提供参考及研制开发中草药方剂提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 药物：金银花、穿心莲、蒲公英、连翘、苦参、黄芩、黄柏、板蓝根、大青叶、白头翁。所有药材均购自河南省医药公司。

1.1.2 培养基：普通营养肉汤、普通营养琼脂、麦康凯营养琼脂（均购自北京双旋微生物培养基制品厂）。

1.1.3 菌株：猪大肠杆菌6株、鸡大肠杆菌5株、兔大肠杆菌3株，来自本研究室从患病畜禽病料中分离、鉴定和保存的优势菌株。

1.2方法

1.2.1 中药制备：每味中药均按水提法进行制备，以金银花为例，称取金银花50g，装入具塞三角瓶中，加500ml蒸馏水浸泡30min后，加热至沸后文火煎煮30min，用4层纱布过滤，滤出煎液，药渣按上述方法再煎煮一次，合并两次滤液，滤纸过滤，恒温水浴加热浓缩至生药含量为1g/ml，高压灭菌后，置4℃冰箱保存待用。

1.2.2 培养基制备：普通营养肉汤、普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基均按常规方法配制，4℃冰箱保存待用。

1.2.3 菌液制备：将菌种接种于麦康凯琼脂培养基上，37℃培养24h，挑取典型菌落接种于普通肉汤培养基中，置37℃温箱培养24h后，取各菌液0.5ml接种于普通营养琼脂平板上培养8-12h后，用L棒刮取菌苔，用灭菌生理盐水稀释，后与标准麦氏比浊管比浊。并根据比浊管所含的细菌浓度稀释至含菌量106Cfu/ml，备用。

1.2.4 最小抑菌浓度（MIC）测定：用试管二倍稀释法。以板蓝根抗鸡大肠杆菌为例，取灭菌试管11支，编号，每管先加入灭菌肉汤培养基1.0ml，然后于第一管中加入制备好的中药水提液1.0ml，混匀后取出1.0ml放入第二管，依此类推至第9管，弃掉1ml，第10管不加药物，作为阳性对照，第11管加中药水提液化气1.0ml，混匀后取出1.0ml弃去，不加细菌，作为阴性对照。取制备好的细菌稀释液0.1ml分别加入上述1-10管中混匀，第11管加灭菌生理盐水0.1ml。第1管至第9 管药物浓度 （mg/ml） 分别为 500、250、125、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、1.95。置各管于恒温培养箱中37℃培养24h，观察结果。阳性对照细菌生长，呈均匀浑浊状，阴性对照管无细菌生长呈澄清、透明状时，试验成立，观察其它各管情况。如试管内液体澄清、透明，则无菌生长。以无菌生长的最低稀释度即为最小抑菌浓度。

1.2.5 最小杀菌浓度（MBC）测定：将上述MIC测定中各管培养物分别画线接种于普通营养琼脂平板，37℃恒温培养24-48h观察结果。菌落数少于3个视为无菌生长，以无细菌生长的药物最低

2 结果 结果见表1

浓度，作为该种药物对该菌的最小杀菌浓度（MBC）。

1.2.6 结果的判定：参考刘忠仪等[5]介绍的判断标准，MIC＜7.80mg/ml，为高度敏感，7.80＜MIC＜250mg/ml，为中度敏感，MIC＞250mg/ml，为不敏感。

表110 味中药对畜禽大肠杆菌的平均MIC和MBC（mg.M1-1）

由表1可知，10味中草药对14株供试菌均有一定的抗菌效果，但不同种类的中草药抗菌效果不同，其中抗菌效果最好的是连翘，MIC＜7.80 mg/ml，属于高度敏感，其次是板蓝根、大青叶、蒲公英、金银花、穿心莲，7.80 ＜MIC＜250mg/ml，为中度敏感，黄芩、白头翁、苦参、黄柏MIC＞250mg/ml，为不敏感。

3 讨论

3.1本试验同时对不同畜禽来源的致病性大肠杆菌进行了体外抑菌试验，结果表明同一种中草药对不同的菌株抗菌效果略有差异，有部分中草药如连翘、板蓝根、大青叶、金银花等对兔大肠杆菌的抗菌效果好于猪、鸡大肠杆菌，这可能和家兔在养殖过程中使用药物较少有关系，一般认为中药不易产生耐药性，但长期、大量使用中草药，会否产生耐药性，还需要进一步实验。目前在中药的耐药性方面的研究很少，应引起重视，积极开展这方面的研究，为合理用药、保障生物安全提供依据。

3.2本试验在测定中药的最小抑菌浓度的同时，还测定最小杀菌浓度，更全面的了解了中药的抗菌活性。另外将不同浓度中药与受试细菌作用后，再分别接种普通营养琼脂平板培养基进行培养，通过观察细菌和中药作用后在培养基上的生长情况来判定最小杀菌浓度，有效的避免了中药煎煮液的色泽及沉淀对观察结果的影响，避免了肉眼观察可能产生的误差。使试验结果更准确、可靠。

3.3本试难采用了中草药水提法测定了中药的MIC。中药水提法由于需要的设备简单、操作方便简单，可以在较短时间内完成大量中药的筛选，因此该法最为常用。但是，水提法以水作为溶剂，可能影响到一些不溶于水的成分的提取，另一方面，药物经加热煮沸，并进行高压灭菌，高温高压可能会使某些中草药的药理活性降低，这些都可能会导致药物的MIC值偏高[6]，因此尚需进行不同提取方法及中药有效成分的研究，以期能够完善提取工艺，更好的发挥中草药的药效。

3.4本试验所得结果为体外抗菌活性，高度敏感的药物很少，但中药治病的机理是利用中药的多重复杂成分共同调节机体平衡，提高机体免疫力，而不是所有成分直接作用于病原菌达到治愈疾病的目的。因此，药物进入体内后能否达到有效的抑菌效果和治愈疾病的目的，还有待于进一步的动物试验。

[1] 陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，2007，215-223。

[2] 雷连成，江文正，韩文愈，等.致病性大肠杆菌的耐药性监测[J].中国兽医杂志，2001，37（1）：12-13.

[3] 吴蕊，许礼发.中药制剂大肠杆菌体外抑杀作用的研究进展[J].医学动物防制，2008，24（5）：352-355.

[4] 褚秀玲，苏建青，韦旭斌.中药抗大肠杆菌病研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（21）：9093-9094.

[5] 刘忠仪，张国威，何云志.解脲支原体中药药敏试验[J].中华皮肤科杂志，1996，29（5）：349.

[6] 侯永清，张挺.不同提取工艺对中草药抑菌效果的影响[J].饮料工业，2003，24（2）：9-10