荧光偏振免疫法测定血中依替米星的浓度

毛 璐，卞 婧，张 威，甄健存 （北京积水潭医院药剂科，北京 100035）

硫酸依替米星系半合成氨基糖苷类抗生素，是我国自行研制的I类新药，其抗菌谱广、抗菌活性强、抗交叉耐药性好，且耳、肾毒性远低于其他氨基糖苷类抗生素，可以用于耐庆大霉素菌株，即产氨基糖苷类钝化酶菌株的感染[1]。既往依替米星的血药浓度测定采用微生物法，操作较为繁琐，检测时间长，而且患者不能同时使用其他抗菌药物[2]，使用受到一定的局限性。近期有报道采用高效液相色谱法进行测定，但是生物样本前处理较为繁琐，提取后还需要进行柱前衍生化，且回收率不高[3]，不能满足日常临床检测的需要。荧光偏振免疫法（fluorescence polarization immunoassay, FPIA）用于血药浓度分析，适用于多种药物的血药浓度测定，具有测定速度快、操作方便、无需预处理样品、取样量少、测定精度和灵敏度高、抗干扰能力强等特点。

1 仪器与试剂

荧光偏振免疫血药浓度测定仪（TDx，美国Abbott公司），庆大霉素TDx检测试剂盒（美国Abbott公司，批号77404Q100），依替米星标准品（中国药品生物制品检定所，批号130365-200301）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

准确称取硫酸依替米星标准品适量，置于10 mL量瓶中，用磷酸盐缓冲液配制成1000 µg·mL-1的浓溶液。

2.2 血清与缓冲液配制依替米星溶液浓度测定的等效性实验

取“2.1”中的浓溶液分别用空白血浆与磷酸盐缓冲液配制成1 µg·mL-1的待测样品，选用空白血清、磷酸盐缓冲液为空白对照品。吸取待测品350 µL，平行测定5次，记录检测值，结果磷酸盐缓冲液配制的依替米星测定值为（0.58±0.06），血浆浓度测定值为（0.56±0.07），经t检验，P＞0.05，两种配制方法无显著性差异。因此，可以使用磷酸盐缓冲液代替血清，进行标准曲线及其他质控点的配制。

2.3 标准曲线的制备

取“2.1”中的浓溶液用磷酸盐缓冲液稀释，配制成0.5，1.5，3.0，6.0，10，20 µg·mL-1的溶液。应用TDx进行测定，以依替米星浓度（X）为横坐标，实际响应值（Y）为纵坐标。最低检测限为0.2 µg·mL-1，得到标准曲线方程为：Y=0.439X+ 0.177 2，r=0.998 1，结果表明：在0.5～20 µg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.4 精密度和准确度考察

2.4.1 取“2.1”中的浓溶液用磷酸盐缓冲液稀释，配制成1，8，16 µg·mL-1的溶液，应用TDx进行测定，于同日测定5次；之后将溶液于－24 ℃冷冻保存，每日融化后测定一次，连续测量5 d，计算日内和日间相对标准偏差。日内标准偏差分别为7.30%，2.54%，1.23%；日间相对标准偏差分别为9.73%，3.32%，1.79%。

2.4.2 取“2.1”中浓溶液用空白血清配制成1 µg·mL-1的溶液，于－24 ℃冷冻保存48 h，冷冻前及室温融化后分别用TDx进行测定，冷冻前、后的结果分别为（0.85±0.11）和（0.95±0.10），n=3，应用t检验，P=0.30，两组数据无显著性差异。

2.4.3 取“2.1”中的浓溶液用磷酸盐缓冲液稀释，配制成1，8，16 µg·mL-1的溶液，应用TDx进行测定，将测定值代入回归方程计算依替米星浓度，回收率=（测定平均值－空白值）/配制液的浓度×100%。结果：低、中、高三个浓度的回收率分别为（93.12±9.74）%，（102.41±2.73）%，（89.50±1.45）%。

3 讨论

3.1 荧光偏振免疫测定法是利用荧光偏振及抗原、抗体竞争结合的免疫反应原理进行血药浓度测定。荧光标记的药物与患者体液中的药物共同竞争抗体。依替米星与庆大霉素结构相似，与庆大霉素的抗原抗体反应有部分交叉，可与庆大霉素竞争同一抗体，本次研究尝试用市售的庆大霉素试剂盒进行依替米星血药浓度的检测就是基于这一原理。本试验结果也证实了这一推断，但是测定值并非依替米星的实际浓度，需要公式进行转化。

3.2 本方法利用依替米星与庆大霉素结构相似的原理进行检测，因此，庆大霉素以及与庆大霉素结构相似的奈替米星和西索米星会干扰依替米星的测定。而其他结构的药物如阿米卡星、氨苄西林、红霉素、万古霉素、头孢类抗生素、喹诺酮类抗生素等对测定的影响均小于1%。临床上对于难治感染，虽然会同时使用2种或2种以上抗生素，但将结构相似的两个氨基糖苷类药物合用的可能性很少，因此对于绝大多数患者使用该方法测定依替米星浓度是可行的。在测定前应该询问患者用药史，如之前使用了庆大霉素、奈替米星及西索米星应考虑到对实验结果的干扰。

3.3 氨基糖苷类抗生素的血药浓度与疗效、毒性反应相关，有效血药浓度窄，血药浓度个体差异大，是非常需要进行血药浓度测定的一类药物，也是抗生素中被监测最多的药物[4]，尤其是用于儿童[5]、老人、以及肾功能不全的患者时。依替米星血药浓度测定中，既往使用的微生物法和高效液相色谱法很难满足临床上日常治疗药物监测的要求，而FPIA法不需要预处理样品，可直接进样检测，样品微量即可进行检测，而且可以检测多种体液，如血浆、血清、尿、唾液、脊髓液、伤处和肾组织提取液等。应用荧光偏振免疫法测定依替米星的血药浓度，方法灵敏度高，操作简便，检测时间短，可以用于临床快速检测依替米星的血药浓度。同时，也可以进一步了解该药在体内的代谢和分布规律，帮助患者个体化用药，发挥药物的疗效，避免或减少毒性反应，为临床合理用药提供重要依据。

[1] 王舒，高永良.氨基糖苷类药物研究新进展[J].解放军药学学报，2009，25(4)∶329-332.

[2] 吴抗美，陈吾法.微生物法测定硫酸依替米星血药浓度[J].中国医院药学杂志，2001，21(4)∶251-252.

[3] 郭巧珍，李培忠，关勇彪.高效液相色谱法测定大鼠血浆和肾脏中硫酸依替米星的含量[J].解放军药学学报，2010，26(3)∶247-248.

[4] 黄正明.关于治疗药物监测和药物不良反应监测若干问题的探讨[J].中国药物应用与监测，2005， 2(1)∶39-42.

[5] 丁俊杰，张智耀.儿科治疗药物监测[J].中国药物应用与监测，2005， 2(2)∶34-36.