肝癌干细胞的分子标记与靶向治疗

陈怡，邵荣光

肿瘤干细胞假说认为只有很小一部分细胞具有引起肿瘤发生、维持肿瘤生长、保持肿瘤异质性的能力，这样的细胞叫肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）。肿瘤干细胞假说认为肿瘤组织与正常组织一样，是由处于各种分化等级的细胞组成的。其中，有一种在数量上占少数的干细胞样细胞，它具有无限的增殖能力和分化潜能，是肿瘤形成的起始细胞。它在肿瘤的发生、恶化、转移、复发中起重要作用。目前已经成功的在白血病、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、鼻咽癌等实体肿瘤中鉴定分离到肿瘤干细胞的存在[1-5]。本文就近几年肝癌干细胞的表面分子标记、分离及成瘤性，以及针对肝癌干细胞的靶向治疗进行了综述。

1 肝癌干细胞的表面分子标记

目前，运用细胞表面分子标记分选的方法获到 CSC 得到广泛的应用，而这些表面分子标记是某些 CSC 的特征标记之一，但它又在正常干细胞甚至上皮细胞广泛表达，所以寻找更好的分子标记成为当务之急。

1.1 CD133

CD133 为5 次跨膜糖蛋白，CD133 蛋白在神经干细胞、表皮干细胞、内皮祖细胞等多种干/祖细胞中都有表达。近年的研究发现，CD133 在白血病干细胞以及脑肿瘤干细胞、大肠癌干细胞、前列腺癌干细胞等多种实体肿瘤干细胞中均有表达[6-7]。Suetsugu 等[8]用 CD133 鉴定肝癌干细胞，体外实验发现相对 CD133– 细胞，CD133+ 细胞有着更高的增殖潜能，且成熟肝细胞标志物 mRNA 的水平较低，而肝癌早期标志物 AFP 的 mRNA 水平明显高于对照组。Ma等[9]用多种已确定的干细胞特异标记物来分选纯化肝癌组织，最终鉴定和分选出了一小部分 CD133 阳性表达的具有干细胞特性的肝癌细胞，CD133+ 细胞具有更强的克隆形成能力、增殖能力和成瘤性。这群细胞具有与前体细胞相似的特性，包括表达干性基因，自我更新能力和非肝细胞系分化的能力。在此基础上，Ma 等[10]运用双向电泳，比较了CD133+ 和 CD133– 亚型蛋白表达，发现 ALDH 与CD133 的表达成正相关，发现 CD133+ALDH+ 细胞具有更显著的成瘤性。Yin 等[11]发现 CD133+ 细胞存在于人肝癌细胞株和原位肝癌组织中，CD133+ 细胞具有更强的成瘤性和克隆形成能力。Yoshikawa 等[12]发现在肝癌细胞和胆管癌细胞中都有 CD133 的表达，分离出来的 CD133+ 和CD133– 在连续培养中能同样产生 CD133+ 和 CD133–细胞。

1.2 EpCAM

EpCAM 是高致瘤性肿瘤细胞的一个标记。Yamashita等[13]发现在肝癌活检标本中，EpCAM+ AFP+ 亚型细胞在基因表达和信号通路分析中具有肝癌干细胞/前体细胞的特性。而从肝癌细胞中分离的 EpCAM+ 细胞具有肿瘤干细胞特性，具有自我更新能力和分化能力，并在体内有更强的侵袭能力。Kimura 等[14]发现肝癌 EpCAM+ 亚群具有更强的克隆形成率，然而细胞增殖没有差别。体内致瘤实验，运用了超免疫缺陷 NOD/SCID/γcnull（NOG）鼠，发现最少 100 个EpCAM+ 细胞能形成肿瘤，而 EpCAM- 细胞不能成瘤。不论在体外还是体内，EpCAM+ 细胞能交叉分化出EpCAM+ 和 EpCAM– 细胞，而 EpCAM– 细胞保持其表型。有趣的是，导入外源性的 EpCAM 到两群细胞中，尽管 EpCAM 表达量一致，却只能显著增加 EpCAM+ 克隆的成瘤性，而对 EpCAM– 克隆没有影响。

1.3 CD90

Yang 等[15]从 6 种肝癌细胞株中分离 CD90+ 和CD90– 的细胞，发现 CD90+ 细胞显示出成瘤的能力，更容易形成裸鼠肺转移病灶，而非 CD90– 的细胞。还发现在肝癌肿瘤标本和肝癌患者的血液样本中，都有较高比例的CD45– CD90+ 细胞。从移植瘤内分离到的 CD90+ 细胞可在免疫缺陷小鼠体内二次成瘤及三次成瘤。

1.4 其他表面标记

Yang 等[16]用肝前体细胞（卵圆细胞）标志 OV6 从肝癌细胞株及原位癌组织中分离出了 OV6+ 细胞，该细胞亚群具有 Wnt/β-catenin 通路内源性活化。OV6+ 细胞与OV6– 细胞比较表现出更强的体内成瘤性和对常规化疗的耐药。周思朗等[17]用二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌，分离培养肿瘤细胞，按照卵圆细胞表面标记（CD34、c2Kit，Thy21、AFP、CK7、CK8、CK14、CK18、CK19 和 GGT）分选肿瘤细胞，结果发现 CD34、Thy21、CK7、CK8、AFP 和 GGT等 6 个标记的阳性与阴性肿瘤细胞移植裸鼠后，成瘤能力差异显著（P＜0.05 或 0.01）；1/100～1/10 细胞密度的CK7 阴性与 AFP 阳性细胞亚群成瘤能力仍然比其对应细胞亚群为高，CK7（–）和 AFP（+）可能是大鼠肝癌干细胞的部分表面标记特征。

2 肝癌干细胞的分离及成瘤性

目前，CSC 的分离主要通过三种途径：侧群细胞法、表面分子标记以及成球培养。下面介绍近几年肝癌干细胞分离和成瘤性的研究进展。

2.1 侧群细胞

侧群细胞（side population，SP）是一群由于具有 ABC膜转运蛋白而能够将 DNA 染料 Hoechst 33342 或罗丹明123 外排的细胞，利用流式细胞仪可以将这群细胞检测出来。众多实验提示 SP 细胞可能是干细胞或前体细胞的筛选标志。2006年，Chiba 等[18]首次通过 SP 细胞分选得到肝癌干细胞，发现 SP 细胞与非 SP 细胞相比，具有更强的增殖能力，凋亡细胞较少，表达肝细胞、胆管细胞和胚胎肝细胞标志物，具有更强的肿瘤形成能力。SP 细胞在体内外能通过不对称分裂产生 SP 细胞和非 SP 细胞，基因芯片结果发现 SP 细胞表达一些干细胞基因，研究表明肝癌 SP细胞具有肿瘤干细胞特性。Kamohara 等[19]分离了 Huh7 细胞中的 SP 细胞，按照细胞周期分离了 G0 期细胞，发现G0 期细胞具有较高的成球性，并在 NOD/SCID 鼠体内有显著的成瘤性，并且表达肝细胞和胆管细胞分化的标志，表明此细胞亚群具有自我更新、致瘤性和双向分化的特性。目前，SP 细胞法来进行 CSC 的分选可以成功富集得到CSC，但是因为许多 CSC 具有 ABC 转运蛋白以外的逃避药物治疗的机制，这种机制不能单靠采用 Hoechst 染料的方法来鉴定；SP 细胞可能遭受染料的毒性作用而丧失了潜在的干细胞特性，SP 细胞不一定包含所有的 CSC。

2.2 运用多个细胞表面分子标记相结合

除了运用单一细胞表面分子标记，近年来很多研究发现，只有运用两个或者两个以上的 CSC 细胞表面分子标记才能更好地分离 CSC。研究发现，CD133+ 细胞中CD133+CD44+ 亚型是体内形成肿瘤的主要亚型，而非CD133+CD44– 亚型，这类 CD133和 CD44 双阳性的细胞更多地表达干细胞相关基因和更加耐药，这种耐药与高表达人腺苷三磷酸结合盒转运体（ABC）蛋白相关[20]。CD90[15]是一个肝癌干细胞的表面分子标记，进一步研究发现，其中CD90+CD44+ 亚群比 CD90+CD44– 亚群细胞更具有侵袭性，可在免疫缺陷小鼠的肝脏原位成瘤并形成肺转移瘤。

2.3 细胞成球

细胞成球实验是当前鉴定 CSC 的方法之一，过程是原肿瘤细胞经过消化成单细胞后，在无血清培养基中培养直到形成克隆球（肿瘤球），随后进一步证实肿瘤球在传代过程中具有自我更新能力。但肿瘤球仍然是个混合细胞群体，它仅代表一小部分肿瘤起源细胞，有研究表明成球的肝癌细胞有高表达 CD133 肝癌干细胞表面分子标记[21]。目前除了神经球培养条件较为成熟，其他肿瘤干细胞成球培养的条件也是不太一致，限制了这种方法的应用。

3 肝癌肿瘤干细胞的靶向治疗

3.1 分子靶向治疗

针对 CSC 特异的表面分子标志有望成为一条分子靶向治疗的途径。Yao 等[22]运用 CD133 的反义核苷酸敲除了CD133 的表达，抑制了胶质瘤细胞的增殖，降低了肝癌细胞克隆形成能力，改变了周期分布。这说明 CD133 在这些肿瘤细胞生长过程中起了重要的作用，而 prominin-2，CD133/prominin-1 同源蛋白不具有相同功能。

另外，抑制肿瘤干细胞特异通路将成为治疗肿瘤的一条有效途径。Ma 等[23]证明活化的 Akt/ PKB 和 Bcl-2 通路在 CD133+ 肿瘤细胞耐药中起主要作用，运用 Akt1 的抑制剂能增加 CD133+ 肿瘤细胞对常规化疗药物 5-FU 的敏感性。肝癌细胞和具有致瘤性肝前体细胞在缺氧情况下细胞活性增加，HIF-1α 和 Akt 上调，形成 PDGF-BB、Akt/HIF-1α/PDGF-BB 通路组成的自分泌信号环路，引起了细胞对顺铂的耐药。在原位肝癌模型中，加入 HIF-1α 的抑制剂 YC1 后，阻断了缺血性缺氧时 HIF-1α 的活化，显著增强了化疗的效果，导致了肿瘤生长的抑制，延长了动物的生存期。提示 Akt/HIF-1α/PDGF-BB 环行通路作为靶点，有望成为致瘤性的肝前体细胞及肝癌细胞的治疗靶点，更有利于我们从肝癌起源上寻找有效药物[24]。

肝癌细胞有可能由 STAT3+、NANOG+、OCT3/4+ 的肝前体/干细胞转化而来，伴随有 TGF-β 失活，Lin 等[25]在 TGF-β 失活的肝癌细胞中，运用 NSC74859（一种STAT3 的特异抑制剂）能显著地抑制肿瘤的生长，虽然CD133+ 和 CD133– 细胞均对 NSC74859 敏感，IC50 为100 μmol/L，但该抑制剂能显著阻滞体内肿瘤的生长，因此，IL6/STAT3 有望成为更好的肝癌治疗靶点。

在 Wnt/β-catenin 通路内源性活化的 OV6+ 肝肿瘤干细胞中，运用慢病毒携带的稳定表达的 micro-RNA 抑制β-catenin 通路活性，能显著减少 OV6+ 细胞的数量，并且逆转 OV6+ 细胞的耐药[16]。活化 Wnt/β-catenin 通路能增加 EpCAM+ 细胞的数量，而用 RNAi 阻断 Wnt/β-catenin通路的靶点 EpCAM 后能降低 EpCAM+ 细胞的活性[12]。

You 等[26]发现 TGFβ1 调节肝癌细胞中 CD133 表达具有时间和剂量依赖性。TGFβ1 诱导的 CD133 + Hhu7 细胞后，增加了细胞体内形成肿瘤的能力。运用 Smads 抑制剂，减弱了 TGFβ1 诱导的 CD133+ 的表达。在 CD133–的 Hhu7 细胞中，TGFβ1 的刺激抑制了 DNA 甲基转移酶的表达，运用 Smads 抑制剂能部分恢复 DNA 甲基转移酶的活性。提示 TGFβ1 能通过抑制 DNA 甲基转移酶调节CD133 的表达，TGFβ1 诱导的 CD133+ 的表达依赖Smads 通路。

BMI1 在间充质干细胞自我更新中起着重要作用，肝癌中 SP 细胞比非 SP 细胞优先表达 BMI1，慢病毒敲除BMI1 能持续减少 Huh7 和 PLC/PRF/5 肝癌细胞中的 SP细胞数，更重要的是敲除 BMI1 消除了 SP 细胞体内诱发肿瘤的作用，去除对 BMI1 主要靶基因 INK4A 和 ARF的阻断，也不能修复 SP 细胞的自我更新能力[27]。

3.2 促分化治疗

我们推测 CSC 的分化将最终抑制致癌作用，因为CSC 的致瘤性很大程度上是由其自我更新能力决定的。促分化治疗在白血病中取得了很好的效果，那么通过促进CSC 分化在肝癌中的作用尚处于起步阶段。肝细胞核因子（HNF）4a 是肝生成中一个必须的中心转录因子。运用重组腺病毒基因传递系统，将 HNF4a 导入 Hep3B 和HepG2 肝癌细胞，发现 HNF4a 能诱导肝癌细胞分化成肝细胞，能显著地降低干细胞基因的表达，能减少 CD133+ 和CD90+ 细胞的比例。然而，HNF4a 降低 Hep3B 细胞活性是通过诱导凋亡，而对 HepG2 则是引起周期阻滞和细胞衰老。导入 HNF4a 也能降低肝癌细胞成瘤性[28]。

3.3 抗体治疗

单克隆抗体被认为是重要的肿瘤治疗的方式。应用CD44 抗体阻断 CD44 活性，可诱导 CD90+ 细胞体外凋亡，并抑制 CD90+ 细胞在免疫缺陷小鼠体内成瘤。以上实验结果提示，CD90 是一个较理想的肝癌干细胞候选标志物，而 CD44 是针对 CD90+ 肝癌干细胞的潜在治疗靶点[14]。孙力超等[29]分离获得人原位肝癌组织中 CSC，采用独特的技术制备了大容量功能性单抗库，通过对 2964 个杂交瘤克隆的筛选，获得了 116株能与人肝癌干细胞样细胞膜结合的阳性单抗。其中有 33株能识别 SP 分选的 CSC，6株还能识别 CD133+ CSC 和含高比例 CSC 的成球细胞。裸鼠体内致瘤性研究发现，其中 4株单抗分选的阳性细胞的致瘤性较单抗阴性细胞高 100 倍，证明了这 4株单抗是抗肝癌 CSC 的单抗。此外，体外功能研究还证明，这些单抗能显著抑制 SP 分选的 CSC 和成球 CSC 的增殖与成球生长。

除了针对 CSC 本身的抗体靶向治疗以外，针对其局部生存环境的靶向治疗也有望成为一个有效的靶点。其中VEGF 及其受体作为血管内皮血管床的主要成分参与 CSC小生境的构成，但其在靶向治疗 CSC 中的作用有待进一步研究。

4 展望

目前限制肝癌干细胞研究的问题主要集中在以下几个方面：①表面分子标记的特异性差：目前肝癌干细胞的表面分子标记比较杂乱，不同实验室、不同的细胞株、不同来源的临床标本差异性较大，如何结合两个或两个以上的标志也值得思考和实验验证；②动物模型：目前肿瘤干细胞运用的多为NOD/SCID 小鼠，但有文献在裸鼠或者免疫更缺陷的NOG 鼠体内验证肿瘤干细胞的成瘤性。研究发现同一个细胞株，相同的分子标记，在同一个实验中，NOD/SCID 小鼠中仅需要比裸鼠更少的细胞就能成瘤，如何选择合适的动物，需要进一步研究。

靶向肝癌干细胞的治疗将有望给肝癌的治疗带来新的契机，一方面寻找更特异性的表面分子标志显得尤为重要，另一个方面单一靶点治疗显得有限，需要从不同的信号通路上寻找多靶点的药物，针对肝癌干细胞本身和针对肝癌干细胞小生境的治疗相结合也将更加有效抑制肝癌的生长和转移。

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