基因敲除技术在结核病研究中的应用

田玺择 张万江

1989年,美国科学家 Capecchi[1]通过研究胚胎干细胞同源重组原理获得的基因敲除小鼠取得成功,因此,Capecchi与美国科学家Smithies、英国科学家 Evans共同分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,成为基因敲除研究史上的又一里程碑。经过20多年的不断发展,基因敲除技术(gene knock-out)已经广泛应用于生物医学的各个研究领域,尤其在结核病研究中取得了很大进展,基因敲除技术已成为研究结核病发生、发展机制的重要技术手段。笔者综述了基因敲除技术的原理及其在结核病研究中的应用。

基因敲除的原理、打靶载体的构建及其筛选策略

一、基因敲除的原理

基因敲除技术是建立在同源重组(homologous recombination)和胚胎干细胞(embryo stem cells,ESC)基础之上的一种新兴生物技术,也是研究基因功能的一种重要方法。首先要在体外构建携带突变基因的打靶载体,然后将其导入胚胎干细胞或体细胞中,利用基因的同源重组原理,用外源基因序列置换靶基因上的特定序列,通过研究靶基因与外源基因序列整合前后遗传性状的改变来研究靶基因的功能[2]。

由于传统的基因敲除技术所得到的基因突变存在于转基因动物的生殖细胞中,常出现因发育障碍而早期致死的现象,而条件性基因敲除技术可以将靶基因的修饰限制于特定的细胞或个体某一特定的发育阶段,从而解决了这一难题。自1994年Gu等[3]利用Cre/LoxP重组酶系统研制组织特异性基因敲除小鼠获得成功以来,条件基因敲除技术已被广泛应用。条件性基因敲除(conditional gene knock-out)就是在基因敲除的基础上,利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术,使得对小鼠基因组修饰的时间和范围处于一种可控状态。Cre重组酶可特异性识别loxP核酸序列,将loxP序列之间的目的基因切除,在特定阶段、特定细胞中表达Cre重组酶的转基因小鼠可以通过与在基因组中引入 LoxP序列的小鼠交配,使子代小鼠的特定细胞中的靶基因被删除,从而得到了组织特异性Cre转基因小鼠[4-5]。

二、基因打靶载体的构建策略

研究者可根据研究的需要选择相应的载体类型,通常选用的打靶载体有插入型载体和置换型载体。插入型载体的同源序列与靶基因组特定位点发生同源重组后,整个载体整合到了靶基因组的特定位点上,而置换型载体的同源序列与靶基因特定位点发生同源重组后,载体的同源序列取代了靶基因组上的特定序列。

后来又出现了2种新的打靶载体构建策略,1991年Hasty等[6]提出了“hit and run”打靶策略,1993年 Askew等[7]提出了“tag and exchange”打靶策略。

三、基因打靶的筛选策略

由于大多数细胞难以发生同源重组介导的基因敲除,因而基因敲除成功的几率很低。因此,要在基因打靶载体上添加正选择标记基因及负选择标记基因。正选择标记基因有2个功能,一是作为选择标记从转染细胞中分离整合了外源基因的细胞;二是作为突变体置换或插入靶基因的编码外显子,使靶基因产生突变。负选择标记基因的功能主要是对抗打靶过程中产生的非同源重组,起富集中靶克隆的作用[8]。通常选用的筛选策略有正负向筛选法(positive and negative selection,PNS)和PCR筛选策略。

正负向筛选法是指将正选择基因neo插入到打靶载体同源区内的目的片段中,负选择基因HSV-tk则插入到目的片段的外侧。neo基因的插入既可形成基因突变,又是正向标记。而负选择基因 HSV-tk对更昔洛韦(Ganciclovir,GANC)敏感,因此含有HSV-tk的重组细胞可在GANC培养基中被杀死[9]。

PCR筛选法就是在构建好的打靶载体上插入一段特定的核酸序列,通过PCR扩增产物的大小来鉴别插入突变和同源重组。

基因敲除在结核病研究中的应用

一、基因敲除在结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡作用研究中的应用

利用基因敲除技术来研究结核分枝杆菌与宿主巨噬细胞(macrophage)之间的相互作用,对于揭示结核病的发病机制具有重要的科学意义。被感染的巨噬细胞在病原体入侵后产生凋亡小体(apoptotic body)的能力是一种古老的先天免疫防御机制。对类似结核分枝杆菌一样在细胞内长期存在的病原体来说,抑制巨噬细胞凋亡对于其侵入性是非常重要的。

编码Ⅰ型NADH脱氢酶nuoG亚基的结核分枝杆菌nuoG基因,对结核分枝杆菌介导的抑制宿主巨噬细胞凋亡有重要意义。Miller等[10]利用基因敲除技术得到的结核分枝杆菌nuoG缺失株来研究结核分枝杆菌nuoG缺失株与巨噬细胞凋亡之间的关系,证实用半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8及 TNF-α中和抗体来处理含有结核分枝杆菌nuoG缺失株的人巨噬细胞后,结核分枝杆菌nuoG缺失株的凋亡性表型有明显降低。有趣的是,不仅nuoG敲除引起的凋亡可以使伴有活性氧拮抗剂的巨噬细胞潜伏期缩短,而且nuoG引起巨噬细胞分泌TNF-α能力的提高也能达到同样的作用。这表明结核分枝杆菌通过nuoG依赖机制来抵抗活性氧的损害,以此来阻止TNF-α介导的宿主细胞凋亡,从而逃避巨噬细胞的杀伤。

巨噬细胞是结核分枝杆菌感染的天然微环境,为了抵抗氧化及亚硝基化,并在巨噬细胞内长久存活,结核分枝杆菌具备一种非常有效的抗氧化复合体系。在这些抗氧化剂酶当中,TpX是结核分枝杆菌中惟一与硫醇过氧化物酶有同源序列的蛋白,曾有研究者报道体内结核分枝杆菌 TpX蛋白的功能与体外过氧化物酶的功能相似,为了研究tpx基因对体内结核分枝杆菌的存活所起的作用,Hu等[11]通过基因敲除技术构建了结核分枝杆菌tpx缺失突变株,结果显示该突变株不能在巨噬细胞中生长和存活,这说明tpx对于结核分枝杆菌抵抗氧化及亚硝基化是必需的。

二、基因敲除在结核疫苗研究中的应用

卡介苗作为预防结核病的接种疫苗,具有广泛使用的安全性和免疫佐剂作用。ERP基因是既存在于有毒结核分枝杆菌又存在于卡介苗中的一个毒力基因,敲除卡介苗中的ERP基因有可能提高卡介苗对免疫缺陷患者使用的安全性。因此,利用基因敲除技术对卡介苗进行改进是开发新疫苗的一种有益尝试。

吴芳等[12]利用基因敲除技术扩增ERP基因两侧序列,连接载体与目的片段,成功构建了卡介苗ERP基因的置换型打靶载体,为进一步构建敲除ERP基因的卡介苗突变株及研究新型结核疫苗奠定了基础。

编码Bruton酪氨酸激酶的btk基因突变可导致伴X染色体(X-linked immune deficiency,XID)的免疫缺陷,该免疫缺陷常伴有B淋巴细胞为主要表型的功能损害。Kondratieva等[13]在前期研究中证明CBA/N-xid小鼠和野生型CBA小鼠不同,在感染结核时不受卡介苗的保护。在T细胞反应性干扰素γ(IFN-γ-producing T-cells)和活化的巨噬细胞作为抗结核的关键因素后,仍然不清楚基因突变是为何主要影响沿T细胞-巨噬细胞反应轴的B细胞功能。因此,Tatiana等[13]利用基因敲除和继承性细胞迁移的方法来论证说明先前未受重视的B细胞抑制中性粒细胞趋化作用的能力。证明B细胞缺陷会导致中性粒细胞异常快速的向外界刺激物迁移。在这项研究中,利用中性粒细胞代替巨噬细胞的方法可大量减少T细胞反应性干扰素γ和损伤的卡介苗,从而使一种更先进的卡介苗捕获能力在XID小鼠中得以实现。

有研究表明存在于分枝杆菌细胞壁上的脂甘露糖阿拉伯糖聚糖(LAM)和脂甘露聚糖(LM)对机体免疫反应的调节有重要意义[14]。em bC基因则参与了前体LM合成LAM的关键环节[15]。李娅莎等[16]根据基因敲除方法,首先以质粒p2N IL为载体构建了卡介苗em bC基因打靶载体,筛选鉴定后将阳性克隆后电转入卡介苗中,从而构建出卡介苗em bC基因敲除株,使其细胞壁上的LMs/LAMs的比例发生改变,为卡介苗免疫活性的研究奠定了可靠基础。

三、基因敲除在结核分枝杆菌毒力基因研究中的应用

毒力基因的研究对于阐明结核的发病机理,开发抗结核新药及结核疫苗有非常重要的意义。SecA1和SecA2是目前研究较多的毒力基因,在结核分枝杆菌中,SecA1是最基本的总务蛋白,而SecA2则是辅助分泌因子。Miriam等[17]通过基因敲除技术构建了结核分枝杆菌SecA2缺失突变株,该突变株在大鼠体内的毒力有明显减弱。通过比较野生型结核分枝杆菌和SecA2缺失突变株,发现超氧化物歧化酶A(SodA)是依赖SecA2分泌的蛋白,而SodA缺乏经典的蛋白排出信号序列,提示SodA排出方式是一种新的分泌旁路,Miriam等[17]的研究表明这种分泌旁路是结核分枝杆菌逃避巨噬细胞杀伤的毒力机制之一。

已有研究表明,RD1是卡介苗和毒力菌株之间惟一有差别的区域,卡介苗不含RD1,而RD1存在于所有结核分枝杆菌有毒菌株中。Lewis等[18]敲除了H37Rv强毒株中的RD1基因,并研究其感染人单核细胞(T HP-1)、由人外周血单核细胞衍生的巨噬细胞及C57BL/6小鼠后的毒力变化,发现在以上3种系统中,H37Rv RD1基因缺失突变株的毒力比结核分枝杆菌的毒力有显著下降,并与卡介苗类似。因此,研究RD1基因对于了解结核分枝杆菌的毒力及卡介苗的减毒作用都具有非常重要的意义。

结 语

基因敲除技术在结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡作用及结核疫苗的研究等方面应用较为广泛,但在毒力基因、耐药性及临床诊断方面的应用较少。研究结核分枝杆菌毒力基因对于彻底了解和控制结核分枝杆菌具有非常重要的意义。目前,虽然成功证实了一些结核分枝杆菌的毒力基因,但对毒力基因的调控机制及其功能却知之甚少,而基因敲除技术在基因功能的研究方面有其独特的应用价值。由于基因敲除可以实现靶基因功能的完全丧失,而基因沉默是使基因不表达或低表达,因此其对毒力基因及耐药基因功能的研究具有RNAi等基因沉默技术无法替代的作用。相信随着分子生物学的快速发展,基因敲除技术在结核病各方面的研究中将会迎来更美好的应用前景。

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