毛细管电泳法测定雷公藤饮片中雷公藤红素的含量

张 婷

（鲁东大学 生命科学学院,山东 烟台264025）

雷公藤红素（celastrol），存在于雷公藤（Tripterygiumwilfordii Hook.F）中。体外药理实验证实雷公藤红素具有抗炎、抑制肿瘤细胞增殖等作用，有良好的治疗肿瘤的应用前景[1,2]。鉴于雷公藤红素的毒性很大，为了有效控制雷公藤制剂的质量，必须建立准确快速测定雷公藤红素含量的方法。目前，关于雷公藤红素的含量测定，主要是高效液相色谱法（HPLC法）[3,4]。毛细管电泳法是用于药物有效成分分离和含测较为有效的一种方法[5,6]，但运用毛细管电色谱分离和测定雷公藤红素的研究尚未见报道，本文首次探索了采用毛细管区带电泳测定雷公藤红素的方法，方法简单，时间快，有较好的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HP3DCE毛细管电泳仪（美国惠普公司，二极管阵列检测器，检测波长200～600nm）。

雷公藤红素（CSL）标准溶液：准确称取CSL（本实验室从雷公藤药材中分离得到，最后经二次重结晶，经HPLC测定，纯度大于99%），加适量甲醇溶解，定容于 100mL棕色容量瓶中，配成 2.0×10-3mol·L-1溶液，用时稀释到所需浓度；雷公藤饮片（采购于烟台市毓磺顶大药房）。

供试品溶液的制备 粉碎适量的雷公藤饮片，过6号药筛，在80℃干燥2h，至恒重。精密称取样品1.000g到5mL的三角瓶中，加适量甲醇，超声溶解15min后，放置10min，再超声溶解15min后，放置三角瓶中直到室温，转移至5mL容量瓶中再加甲醇至刻度，振摇均匀，取3mL溶液超滤后，得到测试溶液；

KH2PO4，K2HPO4，CH3OH，CHCl3等均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司；实验用水为二次蒸馏水；实验开始前均用0.45μm滤膜过滤处理缓冲液、对照品溶液和样品溶液。

1.2 毛细管电泳分析条件

毛细管柱：75μm×80.5cm（毛细管实际有效长度为 72.5cm，未涂层）；采用 0.05 mol·L-1磷酸盐（pH值为6.0）-15%甲醇做为电泳分析缓冲液；30kV运行电压；电泳实验操作温度：30℃；仪器检测波长：210nm，根据实验情况对色谱峰面积统一进行时间校正后再处理；正极进样1kPa×5s。样品分析测试前清洗色谱柱，方法是先用0.1mol·L-1NaOH碱性溶液冲洗色谱柱1min，再用二次蒸馏水冲洗色谱柱1min，最后用实验选好的缓冲液冲洗2min。在本次实验中，雷公藤红素对照品和雷公藤饮片的电泳图谱见图1。

图1 雷公藤红素对照品（A）和雷公藤饮片样品（B）的电泳图谱Fig.1 Capillary electrophoresis chromatograms of chemical reference substance of celestrol(A)and Leigongteng herb drug(B)

1.3 线性关系的考察

取雷公藤红素对照品储备液，准确量取0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8mL，完全转移到 5mL 容量瓶中，容量瓶容积不足的部分用甲醇补足并定容至刻度。取适量样品，按浓度由低到高的顺序依次进样进行测量，按照已经考察好的电泳条件分别测定8个对照品溶液的峰面积与迁移时间的比值，并记录测定结果。以峰面积与雷公藤红素迁移时间的比值（Y）作纵坐标，以雷公藤红素浓度 X（mg·mL-1）作横坐标，绘制定量分析的标准曲线。实验结果表明，雷公藤红素的浓度在0.05～0.40mg·mL-1范围内呈现出良好的线性关系。通过统计分析，定量分析的回归方程为：Y=321.41X+1.96，r=0.9990。

1.4 加样回收率试验

精密吸取已知雷公藤红素准确含量的雷公藤饮片样品5份，分别加入0.20mg·mL-1雷公藤红素对照品溶液2mL，按照与样品同样的实验方法测定雷公藤红素含量，然后计算加样回收率。实验结果表明，平均加样回收率为98.94%，RSD为1.72%。

1.5 精密度试验

取浓度为0.20mg·mL-1雷公藤红素对照品溶液，按照与样品同样的实验方法，重复测定5次，实验结果表明，雷公藤红素峰面积RSD为1.12%。

1.6 含量测定

共测定了3批样品，结果见表1。

表1 样品中延雷公藤红素含测结果Tab.1 Determination results of celestrol in Leigongteng herb drug

2 结果与讨论

2.1 缓冲液pH值对雷公藤红素分离的影响

雷公藤红素是三萜类成分，分子中含有酚羟基，在水溶液中的荷电性容易随溶液的pH值的不同而存在不同的分子荷电性，当缓冲溶液的pH值小于7时，雷公藤红素以倾向于以中性分子形式存在，根据毛细管电泳理论，不同的组分是依据电渗进行分离的，中性组分之间在毛细管区带电泳模式下难以实现分离，往往同时出峰，因此雷公藤红素会与样品中的其它中性组分在谱图上有十分相近的出峰时间，难以实现定性和定量分析（如图2中A）。随着缓冲液pH升高，雷公藤红素由中性分子向荷电离子转变，逐步实现了与样品中含有的中性组分达到分离的目的。

图2 缓冲液pH值的影响Fig.2 Effect of pH of buffer solution

由图2可以看出，当pH值大于7时，雷公藤红素以阳离子形式存在，与其他中性组分形成了基线分离，达到了定量分析的要求。通过实验发现，当pH值为8.0时，雷公藤红素分析时间短，分离效果好，所以本实验选择缓冲液pH值为8.0。

2.2 甲醇用量对雷公藤红素分离的影响

通过实验发现，缓冲液中甲醇含量的多少直接影响样品液中雷公藤红素与其它杂质峰的分离效果，见图3。

图3 甲醇用量的影响Fig.3 Effect of methanol

如果不加甲醇，雷公藤红素与其它组分混在一起出峰，达不到基线分离的要求，当甲醇在缓冲溶液中的体积百分比超过达到10%时，可明显改善雷公藤红素可与相邻色谱峰的分离效果，并实现基线分离。但是并非甲醇的量越多越好，因为加入甲醇的同时也会降低电渗流，这样就会延长组分出峰时间，使分析工作的时间延长，综合考虑分离效果和分析时间，本实验选择甲醇体积百分比为15%。

2.3 同存成分的干扰

雷公藤药材中的三萜类化学成分很多，且性质相近，由于常规色谱分析是依据组分的极性进行分离，分析结构、极性相近的组分有一定困难，而本实验采用毛细管电泳法，利用分子的荷电性进行分离，样品谱图中大部分峰呈基线分离，峰形较好，从而保证了目标成分测定结果的准确性。

3 结论

本实验首次运用毛细管区带电泳法对雷公藤中药材中的有效成分雷公藤红素进行了定性定量分析，方法重现性好，分析时间短，能有效地实现各组分的分离，有效避免了其它组分的干扰，可以和其它方法一起做为雷公藤红素成分的分析方法，相互补充，可以适用于含雷公藤红素的中药制剂的分析测定。

［1］Chang FR,Hayashi K,Chen IH,et al.Antitumor agents.228.five new agarofurans,Reissantins A-E,and cytotoxic principles from Reissantia buchananii［J］.J.Nat.Prod，2003,66（11）:1416-1420.

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