快速起搏对家兔心房肌钙通道表达的影响及螺内酯干预的研究

王联发，顾 磊，吴振西，罗 骏，张淑华

(1.中国人民解放军105医院心内二科，合肥230001;2.江西省人民医院心血管研究所，南昌330006)

心房纤颤(简称房颤)是临床上最常见的持续性心律失常，可引起心力衰竭、脑卒中等严重的并发症，其防治一直是临床实践中的难点。研究证实心房结构重构和电重构在房颤的发生和维持中起重要作用，而心房肌L型钙离子通道在电重构中起着关键作用。本研究通过人工心脏起搏的方法建立急性家兔房颤模型，检测心房肌钙离子通道α1C亚基及β1的表达的变化，探讨螺内酯对急性房颤心房L型钙离子通道亚基表达的影响，从而为螺内酯应用于临床防治房颤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取健康普通家兔18只，雌雄不限，由南昌大学实验动物中心提供，体质量2.0～ 3.2 kg。随机分为 3组，对照组、起搏组、螺内酯组，各6只。螺内酯组以螺内酯20 mg/(kg·d)灌胃给药2周，其余两组以等容量生理盐水灌胃2周。

1.2 房颤模型的建立 3%戊巴比妥钠按30 mg/kg经兔耳缘静脉注射麻醉后，静脉推注肝素1000 U;将兔仰卧固定于兔台，记录体表心电图，颈部正中切口，分离右侧颈内静脉并切开，近头端结扎，置入1根4F四极电极导管(电极间距5 mm)至右房，插入深度约6 cm，将远端电极对与心电图左、右手电极相连，心电图机调为Ⅰ导联，记录心内双极导联心电图，示大A小V，表明电极位于右心房，固定好电极导管。经耳缘静脉注射阿托品和美多心安以阻断自主神经对心率的影响，阿 托 品 首 剂 0.04 mg/kg静 脉 推 注，以 后0.007 mg/(kg·h)静脉滴注维持，美多心安首剂0.2 mg/kg，以后 0.02 mg/(kg·h)维持。起搏组和螺内酯组采用心脏电生理刺激仪连续单刺激模式进行8 h的快速心房起搏，起搏周长 100 ms，脉宽0.5 ms，电压4 V。对照组植入起搏电极，但不行高位快速右房起搏刺激。

1.3 L型钙通道α1C、β1亚基mRNA表达的测定

1.3.1 引物设计 根据设计要求，应用 Primer5.0软件进行设计，送上海博亚生物技术有限公司合成，引物长度和反应条件见表1。

表1 引物序列及聚合酶链反应条件

1.3.2 RNA的提取 根据实验分组，起搏结束后，在家兔麻醉的状态下，无菌技术开胸，迅速取出心脏，在无钙台氏液中漂洗心脏，剪下右心房组织，放入液氮中冷冻保存。将心房组织充分研磨、匀浆，在RNA提取试剂Trizol中充分匀浆，按照Trizol试剂盒操作说明提取总RNA，所提RNA溶于30 μL无酶水中，核酸定量测定仪测定RNA浓度和纯度，并行质量分数0.8%的琼脂糖凝胶电泳，观察RNA的完整性。

1.3.3 心房肌α1C及β1mRNA的检测 反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测各组心房肌α1C和β1mRNA的变化。将1 μg总RNA按照Promage试剂盒操作步骤行20 μL体系反转录反应，所得cDNA作为模板，后续25 μL体系PCR试验。PCR体系:5 μL cDNA，12.5 μL PCR Master Mix，5.5 μL 无核酶水，上游及下游引物(10 μmol/L)各1 μL。PCR产物在质量分数为2%的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统成像并测定吸光度值(A值)，以GAPDH为内参照，将Aα1C/AGAPDH以及Aβ1/A GAPDH比值进行统计学分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 L钙通道各亚基mRNA产物的电泳结果 L钙通道各亚基mRNA经半定量RT-PCR电泳结果见图1，各目的基因和内参GAPDH扩增条带位置和理论值相符。

图1 L型钙离子通道α1C和β1的mRNA产物的琼脂糖电泳结果

2.2 L型钙通道各亚基mRNA的表达结果 快速心房起搏8 h后，心房肌L型钙通道α1C和β1亚基mRNA表达与对照组相比分别下降22%和26%，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，而螺内酯组下降幅度明显减少，分别为13%和17%，与起搏组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，说明螺内酯对快速心房起搏导致的L型钙离子通道表达有一定的保护作用(表2)。

表2 L型钙通道各亚基mRNA的表达结果

3 讨论

近年来研究发现，心房电重构在房颤的发生和维持中起着关键的作用，而L型钙通道可能是快速心房肌电生理重构的始动因素。钙通道离子流是心肌细胞动作电位及其兴奋功能的主要组成部分，心肌细胞有多种Ca2+通道蛋白，其中L型钙离子通道在心脏复极中起重要作用，L型钙通道在动作电位初始时即被激活产生内向电流，并延续整个平台期，所以L型钙通道功能的变化，都可导致心律失常。Ica-L通道在心房重构中起着重要的作用，已经在许多动物试验及临床试验中得到证实［1，2］。van der Velden等［3］在山羊模型上同样观察到与窦性心律相比，持续性房颤心房肌的α1C的mRNA表达显著降低。国内马瑞彦等［4］通过心房快速起搏家兔模型发现，L型钙通道亚单位α1C的表达在快速起搏3 h后无变化，起搏6 h后表达明显下调17.35%，起搏12 h时进一步下调。1995年Wijffels等［5］利用快速心房起搏建立房颤的山羊动物模型，并发现心房快速起搏引起的电生理改变与房颤患者相同，奠定了快速心房起搏模型用于房颤发生机制研究的基础。本实验利用家兔快速心房起搏8 h模拟建立心房纤颤的模型来观察L型钙离子通道的改变。本研究发现，快速起搏组心房肌L型钙离子亚基mRNA表达下降，可引起心房肌细胞动作电位2相时程相对缩短，使该部位心肌复极相对加速，从而导致各部位心房肌复极不一致，容易形成房内折返，发生房性心律失常。螺内酯组心房肌细胞L型亚基mRNA表达下降幅度减小，提示螺内酯可通过抑制L型钙通道下降，使动作电位时程延长，使心房肌细胞电生理活动变化减小，减少心律失常发生，产生心肌保护作用。

大量的研究证实醛固酮在心房重构中起着重要的作用。早在20世纪90年代，Berglund等［6］研究发现，房颤患者的血清醛固酮水平明显高于窦性心律者。Goette等［7］发现，房颤发作时血清醛固酮水平明显升高，在电复律48 h后血清醛固酮水平较复律前显著下降，而房颤复发后血清醛固酮水平又再次升高。Dixen等［8］研究发现，与窦性心律者相比，房颤患者血浆醛固酮水平明显升高。醛固酮在房颤中的作用日益引起人们的关注，以往认为使用血管紧张素转化酶抑制剂或血管及张素受体拮抗剂类药物就能有效抑制醛固酮的作用，然而近年来研究发现，由于“醛固酮逃逸”现象的存在，血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂类药物并不能完全长期抑制醛固酮的产生。醛固酮受体拮抗剂螺内酯作为利尿剂在临床上广泛应用于心力衰竭、高血压等疾病的治疗，在实验中观察到螺内酯虽然能够在一定程度上降低快速心房起搏家兔心房肌细胞的L型钙通道亚基mRNA下降的趋势，但是仅仅研究了螺内酯对急性房颤L型钙通道亚基具有一定的保护作用，是否对慢性房颤也具有类似效果，还需要进一步探讨。相信，随着对醛固酮受体拮抗剂在房颤中作用研究的深入，醛固酮受体拮抗剂螺内酯有可能成为未来逆转心房重构，降低心房纤颤的发生率，防止心房纤颤复发的重要措施之一。

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［4］马瑞彦，肖颖彬，陈劲进.快速心房起搏对家兔心房肌细胞内钙离子浓度及L-型钙通道表达的影响［J］.中华医学杂志，2006，86(27):1926-1928.

［5］Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats［J］.Circulation，1995，92(7):1954-1968.

［6］Berglund H，BoukterS，Theodorsson E，et al.Raised plasma concentrations of atrial natriuretic peptide are independent of left atrial dimensions in patients with chronic atrial fibrillation［J］.Br Heart J，1990，64(1):9-13.

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［8］Dixen U，Ravn L，Soeby-Rasmussen C，et al.Raised plasma aldosterone and natriuretic peptides in atrial fibrillation［J］.Cardiology，2007，108(1):35-39.