IL-1β对大鼠腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1表达的影响①

丁 红 闵 睿 王宗谦 （中国医科大学附属第四医院肾内科,沈阳 110032）

IL-1β对大鼠腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1表达的影响①

丁 红 闵 睿 王宗谦②（中国医科大学附属第四医院肾内科,沈阳 110032）

目的:研究白介素1β（Interleukin-1beta,IL-1β）对原代培养大鼠腹膜间皮细胞（PMCs）葡萄糖转运蛋白 1（GLUT1）表达的影响,为防治腹透失超滤提供理论依据及方法。方法:胰蛋白酶消化法进行雄性Wistar大鼠PMCs的原代培养及传代,不同浓度 IL-1β（0、1、10、50 ng/ml）作用不同时间（0、1、12、24、48 小时）,逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测 GLUT1 的 mRNA 表达,Western blot检测GLUT1蛋白的表达,生化分析仪检测培养液内葡萄糖浓度的变化,以培养液内葡萄糖的减少量作为细胞对葡萄糖的净利用。结果:IL-1β以浓度及时间依赖方式促进GLUT1mRNA及蛋白的表达（P＜0.05）,同时伴有葡萄糖向细胞内转运的增加,50 ng/ml IL-1刺激48小时后GLUT1mRNA表达与对照组相比增加了近4倍（P＜0.01）。结论:IL-1β可以使PMCs细胞GLUT-1表达和葡萄糖摄取增加,这为防治腹透相关腹膜纤维化及腹透失超滤提供了线索。

IL-1β;葡萄糖转运蛋白1;腹膜间皮细胞

长期接受腹膜透析（Peritoneal dialysis,PD）的患者,慢性腹膜炎症及高糖透析液对腹膜的损伤是导致腹膜纤维化,PD失败的两个重要原因,而二者间的关系尚不清楚。近年来研究表明,易化扩散性葡萄糖转运蛋白1（Glucose transorter 1,GLUT1）是介导腹膜间皮细胞葡萄糖摄取的主要转运蛋白,高浓度葡萄糖透析液可使其表达及功能状态异常,导致腹膜间皮细胞的糖摄入及代谢紊乱,从而引起其损伤。本实验应用炎症因子白介素1β（Interleukin-1beta,IL-1β）对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞（Peritoneal mesothelial cells,PMCs）GLUT1表达的影响,以进一步探讨PD腹膜损伤的发生机制。

1 材料与方法

1.1 PMCs的原代培养及鉴定 雄性Wistar大鼠,6周,（224±17）克,无菌取鼠大网膜,0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA 37℃消化20分钟,胎牛血清（FBS）终止消化,4℃,800 r/min,离心5分钟,用含10%FBS的M199生长液（华美生物有限公司）重悬细胞,接种于25 cm2涂有鼠尾胶原的培养瓶,37℃、5%CO2培养箱中孵育,当细胞融合达80%时传代。当二代细胞融合至90%时,行细胞角蛋白（Sigma公司）免疫组化染色,倒置显微镜观察、鉴定。

1.2 实验分组 二代细胞融合达 80%时,加入维持液（2%FBS的M 199）培养24小时后进入实验阶段。加入处理因素IL-1β（Sigma公司）,分为以下几部分 :①IL-1β不同浓度0、1、10、50 ng/ml分别作用PMCs 24 小时,②IL-1β（50 ng/m l）作用 0、1、12、24、48小时,每组设3个复孔。

1.3 GLUT1mRNA检测 按照Trizol说明书在6孔板中提取总RNA,经紫外分光光度计鉴定,各组260 nm/280 nm吸光度（A）为1.5～1.9,表明所提取的 RNA纯度高,根据260 nm A比值计算RNA浓度。取总RNA 2μg作逆转录,按逆转录试剂盒说明操作（TaKaRa公司）。取1μl逆转录产物为模板,GLUT1、β-actin同等条件扩增。引物由上海生工生物工程有限公司合成,各引物设计见表1,反应参数如下:预变性94℃5分钟,变性94℃45秒,退火58℃45秒,延伸 72℃60秒,β-actin 24个循环,GLUT1 32个循环,最后72℃延伸10分钟。将等体积PCR产物置于2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭（EB）染色,在UVP凝胶成像系统中扫描观察结果、拍照,并计算GLUT1与β-actin灰度值比率。

1.4 GLUT1蛋白检测 取各组细胞,PBS洗2遍,加入SDS细胞裂解液,收获蛋白质。取适量的蛋白质标本,10%丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶上电泳,电压60 V 30分钟,80 V 90分钟。室温恒压100 V维持60分钟。丽春红染色硝酸素纤维膜,观察蛋白转移结果。TBST洗膜:室温下10分钟。5%脱脂奶粉阻断:室温下轻摇60分钟。TBST洗膜:室温下10分钟×3次。抗原抗体免疫反应加入5%脱脂奶粉稀释的GLUT1（SantaCruz公司,Sc-7903）或GAPDH（Sigma公司）抗体孵育:4℃摇床轻摇过夜。TBST洗膜:室温下10分钟×3次,分别与HRP标记的二抗室温孵育1小时,TBST洗膜,室温下10分钟×3次。显影、检测ECL发光。于凝胶成像系统进行目的蛋白及内参照GAPDH条带灰度分析。

1.5 葡萄糖浓度测定 生化分析仪检测培养液内的葡萄糖浓度,以培养液内葡萄糖（Glu）浓度下降程度代表PMCs对葡萄糖的转运量。

表1 PCR引物设计Tab.1 PCR primer design

2 结果

2.1 PMCs细胞的鉴定 光镜下培养的腹膜间皮细胞初呈梭形,约1周后细胞可达融合,此时细胞呈多边形,形成铺路石样外观。免疫组化染色分析发现细胞角蛋白抗原阳性（图1）,第Ⅷ因子相关抗原阴性。

2.2 IL-1β作用不同时间对PMCs细胞GLUT1 mRNA表达的影响 IL-1β（50 ng/m l）作用PMCs不同时间,RT-PCR方法检测GLUT1mRNA的表达,可见随着时间延长,GLUT1mRNA表达明显增加,呈时间依赖性（*.P＜0.01）,48小时后GLUT1mRNA增加4倍（图2）。

图1 免疫组化染色细胞角蛋白（×10）Fig.1 Immunolhistochem istry stain for cell keratin（×10）

图2 IL-1β作用不同时间对PM Cs细胞GLUT1mRNA表达的影响Fig.2 The effect of IL-1βon GLUT1mRNA in PM Cs for different time Note:*.P＜0.01.

2.3 不同浓度IL-1β对PMCs细胞GLUT1mRNA表达及葡萄糖转运的影响 不同浓度 IL-1β（0、1、10、50 ng/m l）作用PMCs 24小时后,RT-PCR方法检测GLUT1mRNA表达,可见随着IL-1β浓度增加GLUT1 mRNA表达明显增加,IL-1β浓度为50 ng/ml时,GLUT1mRNA水平较对照组增加2.5倍（*.P＜0.05,**.P＜0.01,图3）,同时伴有葡萄糖向细胞内转运的增加（P＜0.05,表2）。

图3 不同浓度IL-1β对PMCs细胞GLUT1mRNA表达的影响Fig.3 The effect of different dose IL-1βon GLUT1 mRNAPMCs

表2 不同浓度IL-1β对PMCs转运葡萄糖量的影响（±s）Tab.2 The effect of different dose IL-1βon glucose transportation in PMCs（±s）

表2 不同浓度IL-1β对PMCs转运葡萄糖量的影响（±s）Tab.2 The effect of different dose IL-1βon glucose transportation in PMCs（±s）

Note:Oneway ANOVA compared between groups P＜0.01;compared with control group,1）P＜0.05;2）P＜0.01.

Group Control IL-1（1 ng/m l）IL-1（10 ng/m l）IL-1（50 ng/ml）Glu（mmol/L）2.21±0.61 2.89±0.81 3.31±1.021）3.94±1.232）

图4 IL-1β对PMCs细胞GLUT1蛋白表达的影响Fig.4 The effect of IL-1βon GLUT1 protein in PM Cs

2.4 IL-1β对PMCs细胞GLUT1蛋白表达的影响Western blot结果表明IL-1β（50 ng/ml）以时间依赖方式促进PMCs表达GLUT1蛋白,24小时后GLUT1蛋白表达已明显增加（图4A）。随着IL-1β浓度增加GLUT1蛋白表达增加,IL-1β浓度为50 ng/m l时,GLUT1蛋白水平较对照组明显增加（图4）。

3 讨论

无论有无细菌感染,非生理性腹膜透析液均可使腹膜产生慢性炎症,腹膜组织细胞释放大量IL-1、IL-6、TNF-α等炎症介质、细胞因子[1]。研究表明IL-1可诱导腹膜TGF-β表达上调,促进细胞外基质的积聚及间皮下毛细血管的增生,从而促进腹膜纤维化的形成[2]。葡萄糖是腹膜透析液主要的溶质,近年来的研究证实腹膜透析液中非生理浓度的高糖是导致PMCs损伤的主要因素,高糖可引起PMCs上E-钙粘素、β-catenin表达下降,细胞间粘附破坏,微丝骨架解体,从而导致细胞损伤,高糖在PMCs内异常代谢所产生的糖基化终产物（AGEs）或葡萄糖降解产物可促进细胞外基质的分泌、沉积,最终导致腹膜纤维化[3]。

高糖所致细胞损伤、代谢紊乱,细胞内糖摄入过多是启动因素,葡萄糖必须借助葡萄糖转运蛋白进入细胞内才能发挥其毒性作用,葡萄糖转运蛋白分为易化扩散性葡萄糖转运蛋白和钠依赖性葡萄糖转运蛋白,后者需要消耗能量转运葡萄糖。研究发现易化扩散性葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）是介导PMCs葡萄糖摄取的主要载体[4],作者的研究表明高糖可激活PMCs上GLUT1蛋白的表达,GLUT1表达上调或者活性增加使细胞对葡萄糖摄取过多,造成细胞内糖负荷过重和糖代谢紊乱,从而导致PMCs的损伤[5]。

Galardo等[6]报道IL-1可刺激大鼠精子支持细胞GLUT1的表达,同时葡萄糖转运增加。IL-1亦可促进关节软骨细胞对葡萄糖的摄取,给予GLUT1特异性抑制剂-松胞菌素B,则关节软骨细胞对葡萄糖的摄入下降了95%[7]。本研究表明IL-1以时间、浓度依赖方式促进GLUT1 mRNA及蛋白的表达,50 ng/m l IL-1刺激48小时后GLUT1mRNA表达与对照组相比增加了近4倍（P＜0.01）,同时伴有葡萄糖向细胞内转运的增加。因此表明炎症介质可通过上调PMCsGLUT1的表达,使腹透液中葡萄糖快速吸收,渗透梯度维持时间缩短,导致超滤效能下降,另一方面GLUT1表达增加会使细胞内葡萄糖蓄积,诱发细胞的糖代谢紊乱,进而导致细胞损伤、细胞外基质沉积,加重腹膜炎症。关于IL-1对GLUT1的作用机制,目前认为IL-1主要是通过PKC（蛋白激酶C）及P38信号途径促进GLUT1的表达,给予PKC及P38抑制剂均可部分阻断IL-1对关节软骨细胞GLUT1的诱导,而给予JNK及ERK的抑制剂则无此阻断作用[8]。

综上所述,腹膜炎炎症介子可通过对GLUT1的作用加剧高糖透析液对腹膜的损伤,通过阻断GLUT1的表达可能有助于预防和治疗PD腹膜纤维化的发生,改善PD的治疗效果。

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3 HondaK,Hamada C,Nakayama Metal.Impactof uremia,diabetes,and peritonealdialysis itself on the pathogenesis:a quantitative study ofperitonealmembranemorphology[J].Clin JSoc Nephrol,2008;3:720-728.

4 FischerederM,Schröppel B,Wiese Petal.Regulation of glucose transporters in human peritonealmesothelialcells[J].JNephrol,2003;16（1）:103-109.

5 丁 红,马健飞,樊 怡.蛋白激酶C对高糖作用下腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1调节作用[J].中国血液净化,2010;9（1）:37-40.

6 GalardoM N,Riera M F,Pellizzari EHetal.Regulation of expression of Sertoli cell glucose transporters 1 and 3 by FSH,IL1 beta,and bFGF at twodifferent time-points in pubertal development[J].Cell Tissue Res,2008;334（2）:295-304.

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[收稿2011-03-20 修回2011-04-06]

（编辑 倪 鹏）

Effects of IL-1βon glucose transporter 1 expression in cultured rat peritoneal mesothelial cells

DINGHong,MINRui,WANGZong-Qian.DepartmentofNephrology,theForthAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110032,China

Objective:In order toavoid peritomum injury and to improve the efficiency of peritoneal dialysis during the dialysis.Theeffectof interleukin-1beta（IL-1β）on glucose transporter1（GLUT1）expression was investigated in cultured rat peritonealmesothelial cells（PMCs）.Methods:PMCs thathad been harvested from maleWistar rats by Enzymatic disaggregationwere cultivated in different concentrations IL-1β（0,1,10,50 ng/ml）for 0,1,12,24,48 h.The expression of GLUT1m RNA and protein were respectively evaluated by revers transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）and western blot.Glucose concentrationswereexamined by biochem istry analyzer.Results:IL-1βinduced theexpression ofGLUT1mRNA and protein in dose-and time-dependentmanner.Theglucoseabsorption of PMCsincreased also（P＜0.05）.Comparewith the control group,IL-1βat concentration of 50 ng/ml for 48 h could increase the expression of GLUT1 mRNA 4 times（P＜0.01）.Conclusion:IL-1βcan up-regulate theexp ression of GLUT1 and netglucoseutilization of PMCs.This showed us a clue to prevention the ultrafiltration failure of peritoneal dialysis in peritonitis.

IL-1β;Glucose transporter1;Peritonealmesothelial cells

R692.5

A

1000-484X（2011）05-0400-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.004

①本文为辽宁省教育厅科技项目（2008845）和沈阳市科技局科技项目（1053125-1-55）

②通讯作者,E-mail:zqw1813@163.com

丁 红（1971年-）,女,在读博士,主治医师,主要从事腹透相关胸膜纤维化机制的研究,E-mail:dinghong9209@126.com。

·肿瘤免疫学·