CD24分子调节百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤的实验研究①

钟玉霞 葛 睿 吴丽媛 戴 钰 张学军 （天津医科大学基础医学院免疫教研室,天津 300070）

·分子与细胞免疫学·

CD24分子调节百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤的实验研究①

钟玉霞 葛 睿 吴丽媛 戴 钰 张学军 （天津医科大学基础医学院免疫教研室,天津 300070）

目的:探讨CD24分子对百日咳毒素诱导急性肝损伤的影响及其可能的分子机制。方法:建立百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤的实验模型,观察anti-CD24中和抗体（200μg/mouse）和百日咳毒素（200 ng/mouse）联合注射组小鼠的生存率,H&E染色观察小鼠肝组织损伤,血清化学方法检测小鼠谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）等肝功能的生化指标,ELISA方法检测小鼠血清中TNF-α的含量,流式细胞仪分析anti-CD24中和抗体对百日咳毒素诱导小鼠kupffer细胞（存在于肝脏中的巨噬细胞,KC）凋亡率的影响。结果:一定剂量的anti-CD24中和抗体和百日咳毒素联合注射组（实验组）生存率显著低于对照组;H&E染色观察实验组小鼠肝出血程度明显高于对照组,实验组小鼠ALT、AST等肝功能生化指标显著高于对照组（P＜0.05）;ELISA检测实验组小鼠血清中TNF-α明显升高（P＜0.05）;流式细胞术分析表明:anti-CD24中和抗体导致小鼠kupffer细胞坏死百分数增加。结论:CD24分子抑制百日咳毒素诱导的小鼠急性肝损伤。

CD24分子;百日咳毒素;急性肝损伤;枯否氏细胞

CD24分子发现于1978年,最初命名为热稳定抗原。CD24分子能够提供协同刺激信号,使抗原特异性T细胞活化。临床上,CD24分子与系统性红斑狼疮,风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发生密切相关[1-3]。实验证明:CD24敲除鼠能够抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发生[4]。

百日咳毒素（Pertussis toxin,简称PTX）是由百日咳杆菌所产生的一种毒力蛋白,是一种原生型A-B结构毒素,由一个酶活性A原体结合一个B寡聚物组成[5,6]。A原体是单一的多肽,称作S1亚单位,具有腺苷二磷酸核糖基转移酶的活性,能催化G蛋白的α亚基ADP-核糖基化,降低GTP与G蛋白α亚基的结合水平,导致α亚基不能活化,从而阻断了受体对腺苷环化酶的抑制作用。B寡聚物是由S2-S4和S3-S4二聚体和一个S5连接物组成的五聚体,它的功能是通过结合细胞受体,使毒素接近靶细胞。百日咳毒素可以作为佐剂诱导实验性自身免疫病[7]。

本实验在百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤模型的基础上,通过观察anti-CD24中和抗体对该模型的影响,揭示CD24分子在小鼠急性肝损伤中的调节作用并对可能的分子机理进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 百日咳毒素（List Biological Laboratories,产品编号:180）;Anti-CD24中和抗体（本实验室纯化的单克隆抗体）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物模型的建立 C57BL/6小鼠购置于本校实验动物中心。每组6～8周龄同性别小鼠各5只,联合注射组尾静脉注射200 ng百日咳毒素,同时腹腔注射200μg的anti-CD24中和抗体,其它组只注射同等剂量的百日咳毒素、anti-CD24中和抗体或百日咳毒素联合注射同型抗体。注射后每小时观察小鼠的体征。12小时后杀鼠,取肝脏、脾脏等器官。

1.2.2 血清收集 眼缘采集小鼠血液,无菌收集于1.5m l离心管,室温放置1～2小时,待血液凝固后转入4℃过夜,使血清充分析出,11 000 r/min常温离心10分钟分离血清,-70℃低温冰箱保存。再行小鼠肝功能检测。

1.2.3 H&E染色 按照实验时间取出小鼠肝脏等器官,10%福尔马林的PBS溶液固定,5μmol/L组织切片,按常规进行H&E染色。

1.2.4 ELISA方法检测小鼠血清中TNF-α的含量血清保存方法同上,ELISA试剂盒购置于eBioscience公司（货号:88-7324-22）,实验操作按照试剂盒的说明书进行。在Bio-Rad450酶标仪上测定450 nm,参照波长为570 nm,通过标准曲线计算细胞因子含量,所有样品采用复孔。

1.2.5 小鼠kupffer细胞分离方法 由肝门静脉预灌注PBS后分离小鼠肝脏,放入5m l限血清DMEM培养液的6 cm平皿中捣碎（内含0.1mg/m l胶原酶Ⅳ,Sigma公司,Cat.No.C7926和2μg/ml的DNaseⅠ,NEB 公司,Cat.No.M0303）,37℃孵育 30分钟,0.5%FBSDMEM重悬细胞,100μmol/L的strainer过滤一次,25%percoll和50%percoll 4℃,20分钟不连续密度梯度离心,吸取含kupffer细胞的液相,37℃5%CO2孵育2小时,用预温的培养液除去非贴壁细胞,流式细胞仪分析其纯度（F4/80+）大于95%时用于后面的实验。

1.2.6 流式细胞仪分析 分别收集PTX和anti-CD24中和抗体刺激的小鼠kupffer细胞,冷PBS洗1遍,1×106细胞/ml重悬,加入FITC标记的抗小鼠CD11b（ebioscience,产品编号:11-0112-82）,冰上孵育30分钟后,1×annexin-binding buffer重悬细胞,Annexin V-APC抗体和7-AAD标记15分钟后,再加入400μl1×annexin-binding buffer,流式细胞仪检测（FACS Calibur,BD公司）,Flow jo7.5软件分析实验结果。

2 结果

2.1 Anti-CD24中和抗体明显增加百日咳毒素诱导的小鼠死亡率 实验中我们发现:百日咳毒素和anti-CD24中和抗体联合注射组的小鼠在4～8小时内小鼠有50%以上的致死率,能存活的小鼠也表现为呼吸急促、反应迟缓;而同等剂量单独对照组毒素、抗体对照组和百日咳毒素联合同型抗体注射组小鼠表现无明显异常反应（见图1）。

2.2 Anti-CD24中和抗体加重百日咳毒素诱导的小鼠急性肝损伤 H&E染色观察小鼠的肝组织发现:联合注射组小鼠肝出血显著,单纯毒素注射组出血程度较轻,注射PBS的空白对照组无出血现象（图2A）。肝功能指标如ALT、AST等联合注射组显著高于单纯毒素注射组,P＜0.02,见图2B。

图1 Anti-CD24抗体降低百日咳毒素诱导的急性肝损伤小鼠生存率Fig.1 Anti-CD24 down-regulated survival ofm ice which pertussis toxin-induced acute liver injury

图2 小鼠肝组织及肝功能指标检测Fig.2 Detection of liver histology and function induced by pertussis toxin with or without anti-CD24 antibodies

图3 TNF-α在小鼠血清中的表达Fig.3 TNF-αexp ression in m ice serum

2.3 Anti-CD24中和抗体对百日咳毒素诱导的小鼠免疫细胞的可能影响 ELISA检测发现:联合注射组小鼠血清中TNF-α表达显著高于对照组,提示小鼠炎症反应加剧（图3）。由于单核-巨噬细胞是机体内TNF-α的主要来源,而我们在应用Rag1-/-小鼠所做的相同实验发现,缺少T/B细胞没有导致小鼠死亡率发生改变。这提示我们:百日咳毒素所引起的小鼠急性肝损伤可能主要涉及肝脏中固有免疫,而与适应性免疫无关。因此,我们进一步观察 anti-CD24中和抗体联合百日咳毒素对小鼠肝脏中kupffer细胞的影响,流式细胞术分析表明:单纯毒素处理组（2.07%）和anti-CD24（2.39%）处理组早期细胞凋亡率高于对照组（1.44%）;而毒素和anti-CD24联合处理组的巨噬细胞坏死的百分数为37.5%,明显高于其它3组（图4）。

图4 Anti-CD24抗体增加百日咳毒素诱导的小鼠kup ffer细胞坏死Fig.4 Anti-CD24 antibodies increased pertussis toxin-induced kupffer cell death

3 讨论

肝脏是机体有毒物质代谢的重要器官,能够接受来自体循环和肠道来的血液。血液内含有的抗原,如细菌、病毒成分,在肝窦部位将通过kupffer细胞清除或提呈,肝内的其它固有免疫细胞如:树突状细胞、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞以及肝窦内皮细胞、位于内皮下层的星形细胞和肝实质细胞等也可能作为抗原提呈细胞提呈血液中的抗原[8]。尽管细菌毒素诱导的急性肝损伤的分子机理尚不清楚,但目前看,人们公认的引起急性肝损伤机制主要包括细菌及其衍生物直接诱导肝细胞损伤和不良免疫反应介导的肝损伤两个方面:一方面,病原体及其衍生物能够与肝细胞内的蛋白质、脂类和核酸等生物大分子相互作用,导致蛋白质功能障碍、脂质过氧化、DNA损伤和氧化应激,或者引起细胞内离子梯度和钙库紊乱,细胞线粒体功能障碍和能源损失,导致肝细胞死亡和肝功能衰竭;另一方面,肝细胞功能障碍和细胞死亡释放特定信号,活化机体的免疫系统,特别是固有免疫细胞,包括kupffer细胞,NK细胞和NKT细胞,这些细胞不仅通过产生炎性因子（如TNF-α、IL-1β等）加剧肝损伤,而且还能通过分泌的趋化因子招募炎性细胞到肝脏部位,启动机体的固有免疫反应[9,10]。

我们在实验中发现:当一定剂量的百日咳毒素联合anti-CD24中和抗体同时注射给野生型C57/B6小鼠后,小鼠在4～8小时内有50%以上的致死率。其病理表现为肝出血,谷丙转氨酶、谷草转氨酶等肝生化指标异常升高;联合注射组小鼠血清中TNF-α明显高于对照组,提示机体炎症反应加剧。鉴于巨噬细胞是机体内TNF-α的主要来源之一,而我们在应用Rag1-/-小鼠所做的相同实验发现:百日咳毒素与anti-CD24中和抗体联合注射组致死率、肝生化指标和机体炎症因子表达与WT小鼠所得实验结果基本相同（实验数据尚未发表）,由于该基因型小鼠T/B细胞发育障碍,这提示我们:百日咳毒素所引起的急性肝损伤可能主要涉及肝脏中固有免疫,而与适应性免疫无关。因此,我们初步探讨anti-CD24中和抗体对小鼠kupffer细胞的调节作用。流式细胞术分析表明:百日咳毒素和anti-CD24同时处理的巨噬细胞坏死程度明显升高。现已知:固有免疫系统通过Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）和/或Nod样受体（Nod-like receptors,NLR）识别死亡相关分子和/或病原相关分子,但其调控的分子机制尚不十分清楚。最近的研究证明:在对乙酰氨基酚（AAP）诱导的肝坏死模型中,CD24和Siglec-10/G信号传导途径能够有效保护宿主免于致死性肝损伤[3]。在这些发现的基础上,我们提出如下假设:CD24分子可能是机体内毒素诱导肝损伤的一个重要的调节分子,通过抑制免疫反应来保护肝脏免于百日咳毒素的攻击。有关CD24分子作用的靶细胞及可能的信号传导通路的研究正在进行中。

1 Liu Y,Chen GY,ZhengPetal.CD24-SiglecG/10 discriminatesdangerfrom pathogen-associatedmolecular patterns[J].Trends Immunol,2009;30（12）:557-561.

2 Liu Y,Zheng P.CD24:agenetic checkpointin T cellhomeostasisand autoimmune diseases[J].Trends Immunol,2007;28（7）:315-320.

3 Chen G Y,Tang J,Zheng Petal.CD24 and Siglec-10 selectively repress tissue damage-induced immune responses[J].Science,2009;323（5922）:1722-1725.

4 BaiX F,Liu JQ,Liu Xetal.The heat-stableantigen determinespathogenicity of self-reactive T cells in experimental antoimmune encephalomyelitis[J].JClin Invest,2000;105（9）:1227-1232.

5 Kaslow H R,BurnsD L.Pertussis toxin and targeteukaryotic cells:binding,entry,and activation[J].FASEB J,1992;6（9）:2684-2690.

6 Weiss A A,Hew lettE L.Virulence factorsof Bordetella pertussis[J].Annu Rev Microbiol,1986;40:661-686.

7 Toft-Hansen H,Buist R,Sun X Jetal.Metalloproteinases control brain inflammation induced by pertussis toxin in mice overexpressing the chemokine CCL2 in the central nervous system[J].J Immunol,2006;177（10）:7242-7249.

8 Crispe IN.The liver as a lymphoid organ[J].Annu Rev Immunol,2009;27:147-163.

9 Herkel J,Schuchmann M,Tiegs,Getal.Immune-mediated liver injury[J].JHepatol,2005;42（6）:920-923.

10 Holt M P,Ju C.Mechanisms of drug-induced liver injury[J].AAPS J,2006;8（1）:E48-E54.

[收稿2011-01-17 修回2011-03-22]

（编辑 张晓舟）

CD24 regulated pertussis toxin-induced acute liver injury in m ice

ZHONGYu-Xia,GERui,WULi-Yuan,DAIYu,ZAHNGXue-Jun.DepartmentofImmunology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

Objective:To explore the effectof CD24 on pertussis toxin-induced acute liver injury inmiceand the underlyingmolecular mechanism.Methods:acute liver injurywas induced in wild-type（WT）mice by pertussis toxin with（as experimentalgroup）orwithout（as control group）anti-CD24 antibody.Survivalwasobserved in allgroups.Forhistology,liverwasstained withhematoxylin and eosin（H&E staining）.Serum alanine transaminase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）weremeasured by serum chem istry,and TNF-a levelwas detected by ELISA.Apoptosis ofmacrophages inwild typemice was analyzed by flow cytometry.Results:The indicated dose of anti-CD24 antibody（200μg/mouse）caused rapid death in experimental group within 12 hours.Thiswas accompanied by increased amounts of serum ALT and AST,and liver hemorrhage.A massive increase in tumor necrosis factor-α（TNF-α）was also detected after anti-CD24 antibody treatment.Flow cytometric analysis showed that anti-CD24 antibody increased necrosis of kupffer cells in WTmice induced by pertussis toxin.Conclusion:These data reveal thatCD24 inhibit the pertussis toxin-induced acute liver injury inmice.

CD24;Pertussis toxin;Acute liver injury;Kupffer cells

R392.3

A

1000-484X（2011）05-0387-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.001①本文受国家自然基金资助项目（No.30870562、30770432）、天津市应用基础及前沿技术研究项目（No.08JCYBJC07700）和天津市高等学校科技发展基金项目（No.20050109）等项目资助

钟玉霞（1984年-）,女,硕士,主要从事感染免疫的实验研究,E-mail:yuxia0301@163.com;

及指导教师:张学军（1969年-）,男,副教授,硕士生导师,主要从事感染免疫和自身免疫病的实验研究,E-mail:xjzh@tijmu.edu.cn。