芪棱汤对脑缺血再灌注损伤大鼠VEGF、CD34的影响

周荣峰 邓 茜 指导 蒋红玉

1广东省深圳市宝安区石岩人民医院（广东深圳518108）

2暨南大学第二附属医院深圳市人民医院（广东深圳518020）

近期的动物实验发现局灶性脑缺血后可诱导缺血半暗带区的新生血管形成。这种脑血管生成是通过血管生长因子与内皮细胞上表达的酪氨酸受体结合而调控的。但是这种血管形成数量有限，并不足以挽救血液灌注不足引起的损害［1］。血管内皮生长因子（VEGF）是作用于血管内皮细胞的特异性多功能因子，参与脑缺血后脑组织的病理修复过程［2］。治疗性血管新生方法的出现，为急性脑梗死的治疗开辟了一条通向缺血性脑卒中再血管化的新途径［3］。本研究旨在观察芪棱汤对脑缺血再灌注后VEGF表达及微血管生成的影响，以进一步阐明芪棱汤抗大鼠脑缺血再灌注损伤的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠126只，SPF级，体质量（300±30）g，月龄4月左右。由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：2005A010。

1.2 药品与试剂 芪棱汤精制液：主要药物黄芪、桑椹、天花粉、三棱、莪术、枳壳、豨莶草、水蛭等，质量浓度为每毫升含生药1.5g。芪棱汤去养阴药精制液：主要药物为芪棱汤去桑椹、天花粉等，质量浓度为每毫升含生药0.85g。两种精制液均由深圳市人民医院制剂中心提供。VEGF兔多克隆抗体、CD34兔多克隆抗体、PowerVision二步法试剂盒及DAB显色系统均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 分组与给药 126只SD大鼠随机分为芪棱汤组、芪棱汤去养阴药组、模型组、假手术组（6只），前3组每组又进一步分为缺血3h再灌注 6h、12h、1d、3d、7d 5 个亚组，各亚组每组 8 只。 芪棱汤组灌服芪棱精制液、芪棱汤去养阴药组给予芪棱汤去养阴药精制液，其余两组予同剂量生理盐水，剂量均为2mL/100g，每12小时给药1次，连续7d。采用盲法给药，给药由专人负责，造模者回避。

1.4 模型制备 采用Zea longa［4］基础上改良的颈内动脉线栓加环扎法。大鼠清醒后出现同侧Horner征（梗死灶同侧瞳孔缩小，眼裂变小，眼球内陷）、向对侧转圈爬行、提尾向对侧旋转、提尾倒立时对侧前肢屈曲者为造模成功。

1.5 标本采集及检测 除假手术组外，各组在再灌注的各时间点取动物用4%多聚甲醛固定，断头，以视交叉为中线取约4mm厚的脑组织，平分切成2mm厚的脑片，置于4%多聚甲醛中固定。常规石蜡包埋，切片机切片，片厚4μm。 两套切片分别进行VEGF及CD34的SP法染色。检测步骤严格按说明书进行操作。

1.6 图像分析 VEGF阳性细胞评分标准：每只大鼠取相同部位的切片各3张，每张切片在镜下（×400）随机选取缺血区内5个非重叠视野，计算阳性细胞数，取均值（阳性细胞数目/400倍视野）即代表该鼠阳性细胞数，再计算各组均值与标准差。CD34标记微血管计数方法：以CD34染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管单位，但肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数，首先用低倍镜头（×100）扫视整张切片，确定微血管最密集的3个视野（新生血管热点区），然后在高倍镜（×400）视野范围内计数所有染色的微血管，取3个视野计数结果的均数为该切片的微血管数。

1.7 统计学处理 应用SPSS 11.5统计软件。计量资料采用（±s）表示，采用析因设计的方差分析。两样本比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组VEGF免疫组化结果 见表1。VEGF免疫阳性染色呈棕褐色，主要表达于梗死周边区神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等。假手术组梗死周边区VEGF蛋白阳性表达极弱。模型组缺血6h即有表达，12h明显增多，1d达到高峰，以后逐渐下降，一直持续到再灌注7d。芪棱汤去养阴药组、芪棱汤组与模型组表达规律一致；再灌注6h，3组比较无显著差异（P＞0.05）；再灌注 12h、1d、3d、7d，芪棱汤组、芪棱汤去养阴药组与模型组比较均有显著差异（P＜0.05或0.01）；芪棱汤组与芪棱汤去养阴药组有显著差异（P＜0.05或 0.01）。

2.2 各组CD34标记微血管计数结果 见表2。CD34免疫组织化学染色结果显示，微血管形态不规则，管腔由染成棕黄色的内皮细胞围成。假手术组CD34在微血管无阳性表达。模型组CD34微血管在再灌注6h、12h、1d即有少量表达，在再灌注3d迅速上升，持继升高至再灌注7d。芪棱汤去养阴药组、芪棱汤组与模型组表达规律一致。再灌注各时间点，芪棱汤组、芪棱汤去养阴药组与模型组比较均有显著差异（P＜0．05或0．01），芪棱汤组与芪棱汤去养阴药组有显著差异（P＜0．05 或 0．01）。

表1 各组再灌注各时间点缺血周围区VEGF阳性细胞数 （个/视野，±s）

表1 各组再灌注各时间点缺血周围区VEGF阳性细胞数 （个/视野，±s）

与模型组比较，*P＜ 0．05，**P＜0．01；与芪棱汤去养阴药组比较，△P＜0．05,△△P＜0．01。 下同。

组 别 n模型组 8芪棱汤去养阴药组 8芪棱汤组 8 6h 15．51±2．58 17．44±1．26 18．16±1．81 12h 25．47±3．09 31．07±3．66*36．75±2．12**△1d 35．44±2．86 44．68±3．19**50．53±1．53**△3d 24．46±1．75 31．32±3．22**38．37±2．37**△7d 13．89±1．91 21．35±1．97**28．13±2．02**△△

表2 各组再灌注各时间点缺血周围区微血管计数 （个/视野，±s）

表2 各组再灌注各时间点缺血周围区微血管计数 （个/视野，±s）

组 别 n模型组 8芪棱汤去养阴药组 8芪棱汤组 8 6h 8．69±1．98 12．45±1．48*16．02±2．25**△12h 13．36±3．95 19．83±3．44*22．99±2．32**△1d 23．48±3．02 31．29±3．08**34．63±2．81**△3d 50．28±4．56 63．35±2．40**71．30±3．99**△7d 61．61±2．86 74．45±2．85**82．82±3．36**△△

3 讨 论

中医学中增水行舟是指通过滋阴增液来治疗阴（血）虚液亏便秘的方法。本法为清代医家吴鞠通所创，主要针对阳明温病“津液不足，无水舟停”之“大便不下”而设，后同代医家周学海把养血活血法亦归入本法范畴，认为“夫血犹舟也，津液水也”。现增水行舟法已不再局限于便秘治疗，已广泛用于血栓性疾病的治疗中，如脑缺血性疾病、静脉血栓等疾病的治疗。

缺血性中风属“血栓病”的范畴。其病机是脑部脉不通则血不流，内结为血瘀所致的血痹于脑，肝肾阴虚所致的上实下虚是本病的根本，盖津血本同源，阴精不足，脉道固涩，水枯舟停，脉络瘀阻，瘀血内结，瘀痹于脑，发为中风。本课题组在“津血同源”、“阴虚致瘀”等理论的基础上，给合多年临床经验提出了“气阴两虚、瘀血阻络”是缺血性中风的又一重要病机，并在此基础上运用“增水行舟”法之益气养阴活血理论拟用芪棱汤，临床中用于治疗脑梗死等缺血性脑血管病，取得令人满意的疗效。

本研究发现VEGF表达规律有一个逐渐上升和下降的过程，在缺血6h即有较强表达，12h明显增多，1d达到高峰，以后逐渐下降，一直持继到再灌注7d。这符合AngⅡ对血管生成的影响与VEGF呈依赖性的文献报道。除缺血再灌注6h外，各相应时间点12h、1d、3d、7d，芪棱汤组及芪棱汤去养阴药组比模型组的VEGF表达明显增多，且芪棱汤组与芪棱汤去养阴药组有显著差异。结果提示：脑缺血再灌注的超早期，芪棱汤和芪棱汤去养阴药并不能促进VEGF表达，中药制剂的获效可能需要一个较长的治疗过程；芪棱汤和芪棱汤去养阴药均能上调VEGF表达，且芪棱汤的效果优于芪棱汤去养阴药，即益气养阴活血法优于益气活血法。

本研究发现，模型组CD34标记微血管在再灌注6h、12h、1d即有少量表达，在再灌注3d迅速上升，持继升高至再灌注7d，表达高峰时间明显晚于VEGF表达的时间，提示：微血管的增生可能是VEGF促进的结果；VEGF启动血管生成需要一个时间过程。再灌注各时间点，芪棱汤组、芪棱汤去养阴药组与模型组比较均有显著差异，芪棱汤组与芪棱汤去养阴药组有显著差异。结果提示：芪棱汤及芪棱汤去养阴药可能通过刺激VEGF表达，促进血管生成；芪棱汤的促进血管生成效果优于芪棱汤去养阴药，即益气养阴活血法优于益气活血法。

［1］ 杨冀萍，刘新峰．血管内皮生长因子治疗性血管生成作用与缺血性脑血管病［J］．中国组织工程研究与临床康复，2009，13（7）：1354－1360．

［2］ Szpak GM ，LechowiczW，Lewandowska E， etal．Border zone neovascularization in cereral ischemic infarct［J］．Folia Neuropathol，1999，37（4）：264－268．

［3］ 邢影，徐忠信，莽靖，等．大脑局灶性脑缺血再灌注损伤血管内皮细胞生长因子表达的研究［J］．中国危重病急救医学， 2005，17（3）：174－176．

［4］ Zea Longa E，Weinsten P R，Carlom S．Reversible middle cerebral artery occlusion withoutcraniectomy in rat［J］．Stroke，1989，20（1）：84-91．