高糖环境下脂联素对人肾小管上皮细胞增殖和Caspase-3的影响

王健 李兴

高糖环境下脂联素对人肾小管上皮细胞增殖和Caspase-3的影响

王健 李兴

目的探讨脂联素(Adiponectin，ADPN)对高糖环境下人近曲肾小管上皮细胞增殖、凋亡及T-钙黏蛋白(T-cadherin)表达的影响，揭示脂联素在糖尿病肾病中的保护作用。方法将人近曲肾小管上皮细胞用5.5 mmol/L葡萄糖(正常对照组)、30.0 mmol/L葡萄糖(高糖组)、30.0 mmol/L+2.5μg/ml ADPN(脂联素组)分别培养24 h，48 h，72 h后，运用MTT法测定细胞增殖，运用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中Caspase-3的含量，观察细胞凋亡。结果①高糖组人近曲肾小管上皮细胞增殖被抑制(P＜0.05)，加入脂联素(2.5μg/ml)后促进了细胞增殖(P＜0.05)，并呈时间依赖性。②高糖组人近曲肾小管上皮细胞凋亡增加(P＜0.05)，加入脂联素(2.5μg/ml)后延缓了细胞凋亡。结论高糖环境下随着时间的延长，可引起肾小管上皮细胞增生肥大，诱导其凋亡;脂联素可促进细胞增殖，延缓细胞凋亡。

脂联素;肾小管上皮细胞;细胞凋亡

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，严重影响着患者的生活质量和生存率。每年大约有30%～40%DN进展为终末期肾功能衰竭(ESRD)。DN发病机制尚不清楚，多数学者认为其发病是多种细胞因子、生长因子、激素等对高血糖的综合反应的结果。其主要病理改变是细胞外基质(ECM)在肾小管、肾小球聚集，最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化。近年来随着对DN研究的深入，人们已认识到与肾小球相比，肾小管间质病变对肾功能影响更大。DN早期即可发生肾小球硬化(包括小球基底膜增厚和系膜增宽)和肾小管间质纤维化。肾小管间质包括肾小管上皮细胞、血管和间质成分，占肾脏体积的90%以上。DN的肾小管间质相关病理表现有:肾小管基底膜增厚、肾小管营养不良、间质纤维化和动脉硬化。而肾小管上皮细胞损伤后的改变被认为是肾间质纤维化的起始因素。因而，保护肾小管上皮细胞，减少其损伤，去除肾间质纤维化的起始因素，成为本研究的一个切入点。Caspase-3是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡的关键执行者，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。脂联素(Adiponectin，ADPN)是近年来发现的对糖尿病有保护作用的蛋白质，主要由脂肪细胞分泌。多项研究证明脂联素有抗氧化［1］、抗动脉粥样硬化、保肝、抗纤维化及抗炎［2］等多种保护作用，可能在DN发生、发展中具有重要意义。本研究旨在通过高糖环境中脂联素对人肾小管上皮细胞增殖及Caspase-3的影响，探讨脂联素对高糖环境下肾小管上皮细胞的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 HK-2细胞株为人近曲肾小管上皮细胞，购买于中国医学科学院细胞库中心，实验使用第2、3代细胞。HK-2细胞株生长于含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培养液中(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L)，置于含5%CO2浓度的37℃恒温培养箱中培育，每3～4天用0.25%胰酶消化传代，待细胞生长至亚融合状态时，一部分接种于96孔细胞培养板，接种密度为1×105个/m l，待细胞贴壁后，改用无血清DMEM培养液继续培养24 h使细胞同步化后，弃去旧的培养液后用于下一步实验;一部分直接更换为无血清DMEM培养基使细胞生长同步化24 h，用于下一步实验。

1.2 实验分组

1.2.1 细胞增殖检测 ①正常对照组(N组):培养基中含有生理浓度的D-葡萄糖(5.5 mmol/L);②高糖组(G组):培养基D-葡萄糖浓度为30 mmol/L;③脂联素组(A组):在G组的基础上加入外源性ADPN，使ADPN浓度达2.5μg/ml。

1.2.2 Caspase3表达的检测 ①正常对照组(N组):培养基中含有生理浓度的D-葡萄糖(5.5 mmol/L);②高糖组(G组):培养基D-葡萄糖浓度为30 mmol/L;③脂联素组(A组):在G组的基础上加入外源性ADPN，使ADPN浓度达2.5 μg/ml。

1.2.3 MTT方法检测细胞增殖 将对数生长期细胞以1×105/ml密度接种于96孔培养板中。孵育24 h后，改用无血清培养液孵育24 h，使细胞处于相对静止期后按如上方法分为3组，每组设3个复孔，同时设调零孔。分别培育24 h、48 h、72 h进行MTT检测。为排除培养液中营养成分消耗对结果的影响，每隔48 h换一次培养液。反应结束后每孔加入25μl MTT(5 mg/ml)溶液，继续孵育4 h，弃上清，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡30 min后于酶标仪490 nm处测光吸收(OD)值(OD值越大，表明细胞增殖越旺盛)。

1.2.4 酶联免疫吸附技术测细胞培养液中caspase-3的水平

将对数生长期细胞以1×104/ml密度接种于96孔培养板中。孵育24 h后，改用无血清培养液孵育24 h，使细胞处于相对静止期后按以上方法随机分为三组，每组设3个复孔，同时设调零孔，分别培育24 h、48 h、72 h后收集细胞培养上清液进行ELISA检测

2 结果

2.1 高糖对人肾小管上皮细胞增殖及凋亡的影响 24 h、48 h、72 h G组与N组比较细胞增殖受抑制，差异有统计学意义(P＜0.05);24 h、48 h、72 h G组与N组比较细胞凋亡增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、2。

2.2 脂联素对人肾小管上皮细胞的影响 24 h、48 h和72 h A组与G组比较细胞增殖能力明显增加(P＜0.05);细胞凋亡受抑制。在72 h脂联素组细胞增殖旺盛，生长状态良好， 呈亚融合状态。见表1、2。

表1 脂联素对人肾小管上皮细胞增殖的影响(OD值)(±s，n=3)

表1 脂联素对人肾小管上皮细胞增殖的影响(OD值)(±s，n=3)

注:与对照组相比，*P＜0.05;与高糖组相比，#P＜0.05

0.348±0.017 0.558±0.061 0.724±0.011高糖组 0.478±0.006* 0.367±0.014* 0.261±0.011*脂联素组 1.026±0.009# 1.237±0.009# 1.977±0.009 24 h 48 h 72 h对照组分组#

表2 高糖及脂联素对人肾小管上皮细胞上清液中caspase-3表达的影响(ng/ml，n=3)

3 讨论

近年来，糖尿病的患病率逐年升高，已经成为一个威胁人类健康的全球性重大疾病。2008年，国际糖尿病联合会调查显示，目前糖尿病病例数约为1.9亿，带来了严重的社会问题。如何有效治疗糖尿病成为科学研究的焦点，而治疗糖尿病的关键之一是预防和延缓各种糖尿病并发症(如心脑血管疾病、糖尿病肾病、视网膜病变等)的发生、发展。近年调查及研究表明，糖尿病并发症已成为糖尿病患者致残和致死的主要原因。而糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最严重和最常见的慢性并发症之一，是终末期肾病(ESRD)的最常见病因［3］。

糖尿病肾病(DN)发病机制目前尚未完全阐明。目前多数学者认为与遗传易感性、胰岛素抵抗、糖代谢异常、细胞因子、氧化应激以及由此引起的肾脏血流动力学改变等有关。其主要病理改变是细胞外基质(ECM)在肾小管、肾小球的聚集，而最终导致肾小球硬化及肾间质纤维化。由于近曲肾小管在肾单位所处的位置特殊和其重吸收功能，肾小管与尿液直接接触，尿液中的蛋白、细胞因子等有害物质可直接引起肾小管上皮细胞损伤、活化及表型转化，并释放多种炎性因子和生长因子。另外肾脏血流动力学改变、非酶糖化、激素水平异常、蛋白激酶C(PKC)的激活和多元醇途径等在肾脏小管间质病变中也发挥着重要作用。而肾小管上皮细胞损伤后的改变被认为是肾间质纤维化的起始因素，主要因为肾小管上皮细胞在结构上与肾间质紧密相连，损伤后可直接参与间质炎症、纤维化、或通过吸引间质炎性细胞浸润和促进间质固有细胞增殖，而在间质纤维化过程中起重要作用。糖尿病状态下，由于尿糖的产生及间质组织、肾小管周围血管中葡萄糖浓度升高，使近端肾小管细胞持续处于高糖环境中，诱导细胞凋亡，引起肾小管萎缩，进而发生肾小管间质纤维化，导致不可逆的终末期肾功能衰竭(ESRD)。因而，积极保护肾小管上皮细胞能够有效延缓肾小管间质纤维化，对防治DN的进展有重大意义。

细胞凋亡主要通过三条基本途径-死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径完成的。这三条通路的诱因以及起始部分不同，但殊途同归，最终都引起caspase-3的活化，导致细胞凋亡性死亡。Caspase家族是细胞凋亡调控的关键元件，其激活或超常表达均会诱发细胞凋亡［4］，而caspase-3是caspase家族中重要成员之一，人caspase-3基因定位于染色体上4q32-4q35.1，其广泛分布于各种不同类型的细胞中，表达在多种正常组织中，在一些恶性肿瘤的组织中也有表达。正常情况下，它以无活性的前caspase-3形式存在于胞质中，当细胞受到凋亡因素刺激时，它会被系列反应激活诱导细胞凋亡。

本实验以人近曲肾小管上皮细胞株为研究对象，观察到在高糖环境下，随着时间的延长，肾小管上皮细胞增殖明显受抑，细胞凋亡增加。说明糖尿病时，高糖是诱导肾小管上皮细胞损伤的主要因素。与Samikkannu等［5］及Xing等［6］的研究发现一致。即将原代培养的人肾小管上皮细胞短时间暴露于高糖环境下可产生双重效应，先出现细胞增殖，随后细胞凋亡增加。但随着作用时间的延长，细胞增殖受抑制，至96 h出现细胞增殖停滞的现象，细胞形态发生肥大。而在加入脂联素干预组中，肾小管上皮细胞的增殖未受抑制，且随着干预时间的延长细胞增殖能力明显增加，细胞凋亡减少。说明脂联素能促进高糖环境下肾小管上皮细胞的增殖，延缓其凋亡，减轻细胞损伤，对细胞具有保护作用。

［1］Mossalam M，Jeonq JH，Abel ED，et al.Reversal of oxidative stress in endothelial cells by controlled released of adiponectin.JControl Release，2008，130(3):234-237.

［2］Yokota T，Oritani K，Takahashi I，et al.Adiponectin，a newmember of the family of soluble defense collagens，negatively regulates the growth ofmyelomonocytic progenitors and the function ofmacrophages.Blood，2000，96(5):1723-1732.

［3］Hug C，wang J，Ahmad NS，et al.T-cadherin is a receptor for hexameric and high molecular weight forms of Acrp30/adiponectin.Proc Natl Acad sci USA，2004，101(28):10308-10313.

［4］Yan Zhang，Cynthia Goodyer，Andren Le Blanc.Selective and protracted apoptosis in Human primary neuronsmicroinjection with active caspase-3，-6，-7and-8.Neurosci，2000，20:8384-8389.

［5］Samikkannu T，Thomas JJ，Bhat GJ，et al.Acute effect of high glucose on long2term cell growth:a role for transient glucose increase in proximal tubule cell injury.Am JPhysiol Renal Physiol，2006，291(1):162-175.

［6］Xing L，Muxun Z.Expression of c-met stimulated by high glucose in human renal tubular epithelial cells and its implication.Huazhong Univ Sci TechnologMed Sci，2007，27(2):161-163.

030001 山西医科大学第二医院内分泌科

李兴 E-mail:lixinglaoshi@yahoo.com.cn