不同的培养方法对鼠胚体外发育的影响

刘继龙

不同的培养方法对鼠胚体外发育的影响

刘继龙

目的比较鼠胚在不同的培养体系中的体外发育情况，探讨培养液的体积对体外培养的影响。方法把收集的小鼠2-细胞胚胎分成两组，A组于20μl培养液的微滴中培养，B组与50μl培养液的微滴中培养，观察胚胎发育情况。结果96 h后A、B组的囊胚形成率分别为83.64%和81.63%，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论适当体积的培养滴可促进胚胎的体外发育。

小鼠;胚胎;囊胚;体外培养

小鼠卵子体外受精技术是研究受精生理的重要手段，而研究小鼠胚胎体外发育是研究哺乳动物胚胎发育的常规方法之一。为提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率，许多学者对维持受精卵适宜稳定的环境进行了探索［1，2］。选择适宜的培养条件，是获得较高成功率的前提。本文就微滴的体积大小对2-细胞鼠胚体外发育的影响进行了研究。旨在探讨不同的培养方法对胚胎体外发育潜能的影响，并为人胚胎体外培养提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 昆明种小白鼠，购自广西医科大学实验动物中心，体重为25～35 g，按照SPF级实验动物饲养标准条件饲养。

1.2 方法

1.2.1 鼠胚采集 选择4～6周龄雌鼠，于腹腔注射人绝经期尿促性腺激素(hMG)10 IU/只。46～48 h后注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 IU/只。于注射hCG当晚合笼过夜。第二天将阴栓阳性者挑选出来。注射hCG后42～46 h用颈椎脱臼法处死阴栓阳性雌鼠，取出输卵管。在体视镜下划破输卵管壶腹部，收集其中的2-细胞期胚胎，并用含10%SPS的HTF冲洗3遍，再在培养液中冲洗1遍，选取优质胚胎继续培养。

1.2.2 体外培养 本实验采用微滴法培养。于培养前一天按不同的方案做好微滴，并覆盖矿物油，放入37℃，5%CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中过夜平衡，将收集的优质胚胎随机分成两组，A组于20μl培养液的微滴中培养，B组与50 μl培养液的微滴中培养。胚胎在37℃、5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中持续培养96 h，每隔24 h观察鼠胚发育的情况并记录。

1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0分析软件对所得数据进行显著性检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

采用体内受精的方法获取2-细胞胚胎，在相同的培养条件下，A组分裂为4-细胞胚胎的分裂率为89.09%，B组分裂为4-细胞胚胎的分裂率为92.86%，两者比较差异无统计学意义(P＞0.05);A组的囊胚形成率为83.64%，B组的囊胚形成率为81.63%，两者比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但A组的囊胚形成率比B的稍高(见表1)。

表1 不同的培养方法对小鼠早期胚胎体外发育的影响

3 讨论

随着人类辅助生殖技术的不断发展，体外受精-胚胎移植技术现已成为治疗不育不孕的主要手段之一。人类辅助生殖技术包括卵母细胞的体外受精、胚胎的早期体外培养及胚胎移植等过程，这一系列过程要求有一个稳定的模拟母体内发育的体外培养环境及娴熟的技巧。在体外培养过程中，所有与卵子、精子、胚胎接触的耗材和试剂及环境，均有可能存在危害胚胎的因素［1］。活性氧是造成卵母细胞质量下降和胚胎发育不良的重要因素之一。胚胎培养液中的活性氧的来源可能来自胚胎的周围环境。它会引起早期胚胎发育停滞和延迟［3］。另外，由于开启培养箱引起培养箱内外气体交换，室内空气消毒后残留的臭氧也是培养液活性氧升高的主要原因之一。

本研究结果表明在体积为20μl与50μl的微滴中培养，2-细胞鼠胚的囊胚形成率差异无统计学意义(83.64%vs 81.63%，P＞0.05)。但在20μl的微滴中培养的2-细胞鼠胚发育到囊胚阶段的胚胎数比在50μl的多，这可能是由于在整个体外发育过程中胚胎在20μl微滴中受到外界的影响较小而造成。培养基可以吸收部分污染物，如果微滴的体积过大，其与外界环境的接触面就越大，则溶解于培养基中的有害物质就越多，胚胎受到的侵害面积就越大，从而影响胚胎的发育。而较小体积的液滴由于与外界的接触面小，降低了氧化损伤的风险［4］，其提供的培养环境相对于大液滴或者整个培养箱而言是一个小环境，因此可以把由大气候/环境发生改变而产生的有害因素通过小环境的微调作用而缓减，使培养胚胎受到的影响降到最低限度，很好地保护胚胎发育。综上所述，小鼠胚胎体外培养实验除了可以使新建立的辅助生殖实验室熟练IVF的基本操作技能外，还可以为建立一套比较完善的胚胎培养体系提供实验依据，是开展人类辅助生殖技术的基础。选择适量体积的微滴可以有效地降低外界因素对胚胎发育的影响，为胚胎体外培养提供一个稳定良好的微环境。

［1］王利红，连方.两种2-细胞鼠胚体外培养方法比较.中国比较医学杂志，2009，19(11):67-69.

［2］Suzuki C，Yoshioka K，Sakatani M，et al.Glutamine and hypotaurine improves intracellular oxidative status and in vitro development of porcine preimplantation embryos.Zygote，2007，15(4):317-324.

［3］Guenn P，EiMouatssim S，Menezo Y.Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings.Hum Reprod Update，2001，7(2):175.

［4］Bedarwy MA，Falcone T，Mohamed MS，et al.Differential growth of human embryos in vitro;Role of reactive oxygen species.Fertil Steril，2004，82(3):593.

Effects of difference culturem ethods on development ofmouse em bryos in vitro

LIU Ji-long．Maternity and Child Health Hospital of Qinzhou，Guangxi53500，China

ObjectiveTo compare the mouse embryos of development status of difference culture methods in vitro，and explore the affect of volume of cultare solutior for culture in vitro.M ethods Mouse embryos at the 2-cell stage collected after mating were divided into two group.Group A was cultured in 20μl of medium volume，group B was cultured in 50μl ofmedium volume.The embryonic developmentwas observed.ResultsThe blastocyst formation rates at96 hours in group A and Bwere 83.64%and 81.63%respectively.Itwas no difference of the blastocyst rates in group A and B(P＞0.05).ConclusionItmaybe improve the development ofmouse embryos in vitro by appropriatemedium volume.

Mouse;Embryo;Blastocyst;In vitro culture

535000 钦州市妇幼保健院