芦荟多糖对脑缺血大鼠p53蛋白表达的影响

林英勇 吴童 闻喜英 贾惠岚 王怀刚 赵鑫 苏云明

芦荟多糖对脑缺血大鼠p53蛋白表达的影响

林英勇 吴童 闻喜英 贾惠岚 王怀刚 赵鑫 苏云明

目的观察芦荟多糖(AP)对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用，并进一步探讨其作用机制。方法采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉(MCAO)，制备局灶性脑缺血模型，观察芦荟多糖对MCAO模型大鼠脑缺血后神经功能缺损导致的行为学变化，通过免疫组化法检测其对大脑皮质细胞凋亡相关蛋白p53表达的影响，以此探讨芦荟多糖对脑缺血的神经保护作用。结果芦荟多糖能明显降低神经功能缺损评分和抑制MCAO模型大鼠大脑皮质p53蛋白表达。结论芦荟多糖对急性脑缺血具有神经保护作用，其机制可能与芦荟多糖影响凋亡相关蛋白p53的表达有关。

芦荟多糖;脑缺血;细胞凋亡;p53

急性脑血管病是严重危害人类健康的多发病和常见病，具有高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的特点，是目前世界公认的三大死因之一。缺血性脑血管病(ICVD)约占所有脑血管病的75%［1］。本研究建立MCAO大鼠模型，通过观察芦荟多糖对大鼠脑神经损伤的行为学改变和细胞凋亡相关蛋白p53基因表达的影响，探讨芦荟多糖对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用及其作用机制，同时也为芦荟多糖的新药开发及临床应用提供理论依据［2］。

1 材料

1.1 实验动物 雄性 Wistar大鼠，体重(300±20)g，鼠龄4～5个月，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供。(合格证:SYXK黑2008001)。

1.2 实验药品与试剂 芦荟多糖由黑龙江中医药大学药理教研室制备。尼莫地平片(20071125，西安博爱制药有限公司)。银杏叶片(批号:20080126，唐山荣大药业有限公司)。p53抗体(美国SANTA Cruz公司)。PV6001二步法检测试剂盒(北京中杉金桥)。

1.3 实验仪器 ZDJ-1生物组织包埋机(ZDJ-1生物组织包埋机);YT-6生物组织摊烤片机(湖北);DGX-9143B-1电热鼓风干燥箱(上海福玛);BH-2光学显微镜(日本Olympus);医用图像分析处理系统(华海电子有限公司)。

2 方法

2.1 分组与给药方法 Wistar雄性大鼠随机分成7组，每组15只。芦荟多糖高剂量组(80 mg/kg)、中剂量组(40 mg/kg)、低剂量组(20 mg/kg)，西药阳性对照组(尼莫地平片21.6 mg/kg)，中药阳性对照组(银杏叶片135 mg/kg)，模型对照组及假手术组(均给予等容积生理盐水)。各组均连续灌胃给药7 d，在末次给药后30 min，对大鼠实施右侧大脑中动脉阻塞模型手术。

2.2 脑缺血模型制备 大鼠采用稍加改良的Longa和Nagasawa方法［3，4］，将 Wistar大鼠制备为 MCAO 模型。大鼠脑缺血的判定及研究纳入标准采取四分法评分，于MCAO术后(大鼠意识恢复后30 min)对脑缺血大鼠神经功能缺陷进行第1次神经功能评分，评分1～3分者为合格，每组取出8只纳入研究。术后24 h进行第2次神经功能评分。

2.3 p53蛋白表达检测 MCAO大鼠术后24 h神经功能缺损评分后，用10%水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，快速开胸暴露心脏，剪开右心耳，经左心室插管至升主动脉内，灌注约150 ml左右肝素化生理盐水，随后滴注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液200 ml，缓慢灌注并固定。灌注完毕，从枕骨大孔剪开，完整取脑，在相同固定液中4℃固定不超过48 h。再制作病理组织片。以PV6001二步法操作，流水终止反应，苏木素复染，清水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片观察。胞核或胞浆棕黄色为阳性细胞。

2.4 图像分析 400倍光镜下在缺血梗死灶周边区皮质选择5个不重叠的视场，计数阳性染色细胞数，取其平均值。

2.5 统计学方法 采用SPSS 11.5软件包进行统计分析，所有数据以(±s)表示，组间比较用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 AP给药前后各组大鼠神经功能缺损评分情况，见表1。

表1 各组大鼠24 h神经功能缺损评分的基本情况(n=8，±s)

表1 各组大鼠24 h神经功能缺损评分的基本情况(n=8，±s)

注:模型对照组与假手术组比较:▲P＜0.05;▲▲P＜0.01;各给药组分别与模型对照组比较:*P＜0.05;＊＊P＜0.01;

24 h模型对照组 8 等体积 2.18±0.67▲▲ 2.38±0.69组别 n(只) 剂量(mg/kg)神经缺损分数造模后 造模▲▲假手术组 8 等体积 0 0芦荟多糖高剂量组 8 80 2.36±0.71 1.67±0.55*芦荟多糖中剂量组 8 40 2.23±0.74 1.62±0.54*芦荟多糖低剂量组 8 20 2.24±0.72 1.95±0.85西药阳性对照组 8 21.6 2.40±0.73 1.53±0.52*中药阳性对照组 8 135 2.37±0.52 1.64±0.53*

表1结果显示，AP高、中、低剂量组，西药阳性对照组、中药阳性对照组分别与模型对照组比较，造模24 h后神经功能缺损评分均有不同程度的降低，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

3.2 AP对MCAO大鼠大脑皮质p53蛋白表达的影响，结果见表2。

表2 AP对MCAO大鼠大脑皮质p53蛋白表达的影响(n=8，±s)

注:模型对照组与假手术组比较:*P＜0.01，各给药组分别与模型对照组比较:▲P＜0.01，▲▲P＜0.05

个视场模型对照组 8 等体积生理盐水 18.75±2.12组别 n(只) 剂量(mg/kg) 24 h阳性细胞表达平均数(个)/5*假手术组 8 等体积生理盐水 4.88±2.36 AP高剂量组 8 112 15.75±3.06▲▲AP中剂量组 8 56 14.88±2.80▲AP低剂量组 8 28 15.12±2.80▲▲西药阳性对照组 8 21.6 14.25±2.76▲中药阳性对照组 8 135 14.5±3.07▲

实验观察术后24 h芦荟多糖对MCAO模型大鼠大脑皮质p53蛋白表达的影响，表2结果显示，模型对照组与假手术组比较，p53蛋白表达均有增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)。同时AP高、中、低剂量组，西药阳性对照组、中药阳性对照组分别与模型对照组比较，p53蛋白表达均有不同程度的降低，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

4 讨论

脑缺血后，细胞因谷氨酸受体过量激活、钙超载、炎症变化、氧自由基、线粒体和DNA损伤而表现出坏死或凋亡两种死亡形式。细胞坏死主要位于缺血中心区，而细胞凋亡主要出现在半暗带。细胞凋亡是细胞接受导致凋亡的“信号”时，细胞内的蛋白质被激活，启动内部自身基因调控机制，引起细胞自杀性死亡［1］。因此脑缺血时，抑制相关促凋亡基因的表达与调控，可以有效保护神经元。研究表明p53是一种促凋亡基因，p53及其相关基因在脑缺血中的表达与调控，是神经元凋亡的关键环节。脑损伤可导致p53的表达增加［5］，抑制p53的表达对脑缺血组织具有保护作用［6］。另有研究表明脑缺血及再灌注损伤诱导p53基因表达和细胞凋亡的出现是一致的［7］。

本实验以MCAO大鼠为模型，发现芦荟多糖对脑缺血后p53的表达具有显著抑制作用，从而能抑制细胞凋亡，对缺血后脑神经起到保护作用。

［1］侯熙德.神经病学.人民卫生出版社，1996:197.

［2］华东，刚宏林，王志国.芦荟药理作用及临床应用现状.中医药学报，2005，33(5):54-55.

［3］Morgan JI，Curran T.Stimulus-transcription coupling in the nervous system:Involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun.Annu Rev Neurosci，1991，14:421.

［4］赵大卓，杜永强，姜波，苏云明，等.蝙蝠葛酚性碱对脑缺血大细胞凋亡相关蛋白c-fos表达的影响.中国药师，2009，12(8):1005-1008.

［5］Khochbin S，Lawrece J J.Processing of p53mRNA during induced differentiation ofmurine erythrolinkimia cells:is an alered splicing medianism responsible for the post transcriptional control of gene expression.Gene，1998，72:177-185.

［6］Morrison RS，Kinoshita Y，Johnson MD，et al.p53-dependent cell death signaling in neurons.Neurochem Res，2003，28:15.

［7］方媛，魏桂英，梅方武，等.脑缺血再灌注后p53表达与细胞凋亡的关系.同济医科大学学报，2001，30(2):158-162.

Effect of A loe Polysaccharide on protein expression of p53 in rats w ith focal cerebral ischem ia

LIN Ying-yong，WU Tong，WEN Xi-ying，et al．Department of Basic Medicine，Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang 150040，China

ObjectiveTo observe the neuro protective effects and explore the furthermechanism of Aloe Polysaccharide(AP)on cerebral ischemia in rats.MethodsWistar rats with incomplete cerebral ischemia were induced by ligating themiddle cerebral artery occlusion(MCAO)with fishing lines，It was detected the effects of Aloe Polysaccharide on protein expression of p53 with immuneohistochemicalmethod.Meanwhile，It was observed the effect of AP on the changes of ethology due to nerve injury of ratswith MCAO before and after treatments.ResultsAP can inhibit the expression of p53 protein in cerebral cortex and reduce the neurological deficit score.ConclusionAloe Polysaccharide has protecting effecton cerebral ischemia and themechanism of Aloe Polysaccharide against cerebral ischemia is related to affecting the related expression of p53 protein.

Aloe Polysaccharide;Cerebral ischemia;Cell apoptosis;p53

福建省科学技术厅重点项目(项目编号:2006Y0017)

150040黑龙江中医药大学(林英勇 贾惠岚 王怀刚 赵鑫 苏云明);福建中医学院中医系(吴童);牡丹江医学院第二附属医院药剂科(闻喜英)

苏云明