性激素结合球蛋白在妊娠期糖尿病胎盘组织中的变化及其意义

金镇，孙磊，滕卫平，张亚南，艾婉婷，王娉婷

（1.中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004；2.辽宁省内分泌疾病重点实验室，沈阳 110001）

性激素结合球蛋白在妊娠期糖尿病胎盘组织中的变化及其意义

金镇1，孙磊1，滕卫平2，张亚南1，艾婉婷1，王娉婷1

（1.中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004；2.辽宁省内分泌疾病重点实验室，沈阳 110001）

目的探讨性激素结合球蛋白（SHBG）在妊娠期糖尿病（GDM）胎盘组织中的表达变化及其意义。方法 应用RT-PCR、Western blot及ELISA法分别检测GDM胎盘组织中SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG浓度。结果 GDM组与对照组比较：SHBGmRNA（1.839±0.827vs 2.485±1.950）、SHBG 蛋白（1.852±0.645vs 2.522±0.842） 及 SHBG 浓度（2.071±0.417vs 2.495±0.529）都显著降低，有统计学差异（P<0.05）。结论GDM时胎盘滋养细胞存在着SHBG，但其合成和分泌减少，在GDM发病过程中发挥重要作用。

性激素结合球蛋白；妊娠期糖尿病；胎盘

性激素结合球蛋白（sex hormone binding globulin，SHBG）是一种能结合性激素甾体的球蛋白，主要由肝脏组织细胞合成和分泌，其基因编码区位于第17对染色体的短臂（p12-13），由8个外显子和7个内含子组成，长约3kb，并具有多态性，最近研究表明SHBG在胎盘等组织中有不同程度的表达，除能特异性的结合并转运性激素外，还具有介导激素信号传导和类激素样作用，并是糖尿病的危险因素，在妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）发病中起重要的调节作用［1，2］。为此本文分别应用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、 蛋 白 免 疫 印 迹（Western blot）及酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）分别检测 GDM 胎盘组织中SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG浓度的表达，以探讨GDM时胎盘滋养细胞存在SHBG及其表达变化与GDM发病机制的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2008年10月至2010年10月在中国医科大学附属盛京医院住院，妊娠36～41周行择期剖宫产的孕妇（本试验在孕妇知情同意及医院伦理委员会同意下进行）60例，GDM组30例，依据美国糖尿病资料小组（national diabetes data group，NDDG）制定的诊断标准，即葡萄糖负荷试验（oral glucose tolerance test，OGTT），试验中空腹及服糖后 1、2、3h 血浆血糖水平中的2项分别达到或超过5.8mmol/L、10.6mmol/L、9.2mmol/L、8.1mmol/L。对照组 30例。两组均无心、肝、肾和其他内分泌疾病，无既往糖尿病及高血压病史。剖宫产时胎盘娩出后，立即取脐带附着处相对母体面1.0cm×1.0cm×1.0cm和0.5cm×0.5cm×0.5cm大小绒毛组织，冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干后用于RT-PCR者液氮速冻4h后-80℃保存。

1.2 主要试剂

山羊抗人SHBG多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），SHBG ELISA试剂盒（美国R&D公司）。RNA引物由美国Invitrogen英杰生命技术公司合成，TRIzol（Invitrogen）和逆转录试剂盒及PCR相关试剂均购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 RT-PCR法

按照试剂盒说明从冷冻组织中提取总RNA，将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增SHBG及内参照β-肌动蛋白（β-actin）基因片段。SHBGcDNA上游引物是exonVII591-610，序列为5′TGTAGAATCAAATCCCGGGA 3′，下游引物是exonV790-809，序列为 3′TTCCACCACAACAGAAG ACC 5′，扩增片段长度为219bp；β-actin上游引物为 5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′，下游引物为3′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 5′，扩增片段长度为 498bp。SHBGPCR反应体系为SHBGc DNA 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，SHBG 上游、下游引物各0.5μL，10×PCR 缓冲液 2.5μL，Taq 酶（5U/μL）0.2μL。内参反应体系为 β-actincDNA 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，β-actin 上游、下游引物各 0.1μL，10×PCR 缓冲液 2.5μL，Taq 酶（5U/μL）0.2μL。SHBG反应参数设置：42℃65min→95℃5min→40次循环（94℃ 40s→60℃ 1min→72℃ 1min）；β-actin反应参数设置：42℃65min→95℃5min→35次循环（94℃40s→55.5℃1min→72℃1min）取8μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测特异性条带；外扫描仪扫描，通过计算条带面积获得吸光度（A）。以SHBG条带A值与内参照βactin条带A值的比值来表示mRNA的相对表达强度。

1.4 Western blot法

标本中加入裂解液，超声匀浆后，4℃12000r/min离心。上清用BCA法对蛋白进行定量。每份上清液取20μL加样，经SDS-PAGE凝胶进行蛋白分离后，转移至PVDF膜上，室温下封闭缓冲液2h，一抗 SHBG（1∶200，山羊抗人多克隆 IgG，Santa Cruz公司）或GAPDH 4℃过夜。二抗用辣根酶标记的兔抗山羊IgG（1∶3000，北京中杉金桥生物技术有限公司）室温90min。洗膜后加入ECL 1min。凝胶成像分析软件条带灰度分析，读取IOD值以SHBG蛋白的IOD值/GAPDH的IOD值半定量RNA蛋白的水平。

1.5 ELISA法检测SHBG

称重组织加入定量PBS，匀浆后4℃3000r/min离心20min。各组取10μL加入设定的孔中，按ELISA试剂盒说明书操作，在酶标仪450nm处以空白对照孔调零，直接测定吸光度（OD值），并由标准曲线换算成SHBG的浓度值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件包进行处理，SHBG mRNA、SHBG RNA蛋白及SHBG浓度比较应用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SHBG的RT-PCR产物电泳结果

SHBGmRNA在GDM胎盘组织较对照组的表达水平显著降低（P<0.05）。

2.2 Western blot检测结果

人胎盘中可检测出SHBG蛋白条带，并且在GDM中表达量明显小于对照组，灰度值比较差异有统计学意义（P<0.05），见图 2。

2.3 SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG浓度在两组胎盘组织中的变化

GDM组与对照组比较：SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG浓度都显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表 1。

表1 SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG浓度在两组胎盘组织中的变化（±s）Tab.1 The change of SHBG mRNA、SHBG protein and SHBG concentration in both groups ofplacentaltissue（±s）Group n SHBGmRNA（IOD） SHBG protein（IOD） SHBG（nmol/L）GDM 30 1.839±0.827 1.852±0.645 2.071±0.417Control subject 30 2.485±1.950 2.522±0.842 2.495±0.529

3 讨论

SHBG是一种由肝脏合成的循环类固醇结合糖蛋白，它与雄激素的结和力较雌激素高，当SHBG浓度发生明显变化时，对体内雌、雄激素均有明显影响，使体内雄激素/雌激素相对平衡比值发生异常。SHBG受胰岛素、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、性激素、甲状腺素的调节。其中胰岛素是其代谢的重要调节激素，当胰岛素敏感性降低，胰岛素代偿性分泌增加，胰岛素水平升高，可使肝脏SHBG合成减少［3］。目前认为低SHBG是2型糖尿病发生的独立危险因素，是高胰岛素血症性胰岛素抵抗的一个标志［4～6］。尤其在妊娠期间，性激素对SHBG的调节是有限的，胰岛素成为重要的调节因素［7，8］。Bartha等［9］于2000年首次报道GDM妇女血清SHBG减少。Smirnakis等［1］也研究表明早孕非空腹SHBG似乎是最佳的指标来预测随后的妊娠糖尿病。Thadhani等［10］研究表明从孕早期开始血清SHBG的浓度减低的妇女在孕晚期发展为GDM的概率增加，SHBG可以作为GDM预测的一个标志。我们曾研究表明与正常孕妇比较，GDM早孕时血清SHBG就降低，GDM 发病时降低明显［11，12］。

近年来研究表明SHBG除了存在于肝脏还存在于不同的性甾体激素靶组织如睾丸、前列腺、卵巢、子宫内膜、乳腺甚至心脏，人胎盘组织及体外培养滋养细胞中也存在SHBG的表达和分泌［13］。GDM时胎盘SHBG变化非常值得探讨，但尚未见相关报道。本实验结果表明GDM与正常孕妇胎盘中均存在SHBG及 SHBGmRNA，GDM组与对照组比较SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG浓度都显著降低，说明GDM时胎盘合成和分泌SHBG减少。胎盘内SHBG减少可能与肝脏分泌减少机制相似，由于血中高胰岛素水平抑制了胎盘合体滋养细胞SHBG的自分泌或旁分泌从而导致SHBG减少，GDM时胎盘合体滋养细胞损伤也导致了合成和分泌SHBG减少，因此GDM胎盘组织中SHBG表达比正常胎盘组织中显著减少。

GDM时胰岛素抵抗的增加和胰岛β细胞分泌的降低导致了循环血SHBG的减少，而胎盘合成和分泌SHBG减少的原因有待于进一步深入研究。

［1］Smirnakis KV，Plati A，Wolf M，et al.Predicting gestational diabetes：choosing the optimal early serum marker ［J］.Am J Obstet Gynecol，2007，196（4）：410.e1-416.

［2］McElduff A，Hitchman R，McElduff P.Is sex hormone-binding globulin associated with globulin tolerance ［J］.Diabet Met，2006，23（3）：306-312.

［3］Kahn SM，Hryb DJ，Nakhla AM，et al.Sex hormone-binding globulin is synthesized in target cells［J］.J Endocrinol，2002，175（1）：113-120.

［4］Ding EL，Song Y，Manson JE，et al.Plasma sex steroid hormones and risk of developing type 2diabetes in women：a prospective study［J］.Diabetologia，2007，50（10）：2076-2084.

［5］Stefan N，Schick F，Hiring HU.Sex hormone-binding globulin and risk of type 2diabetes［J］.N Engl J Med，2009，361（12）：2675-2676.

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［7］Peiris AN，Stagner JI，Plymate SR，et al.Relationship of insulin secretory pulses to sex hormone-binding globulin in normal men［J］.J Clin Endocrinol Metab，1993，76（2）：279-282.

［8］Haffner SM.Sex hormone-binding protein，hyperinsulinemia，insulin resistance and noninsulin-dependent diabetes［J］.Horm Res，1996，45（3-5）：233-237.

［9］Bartha JL，Comino-Delgado R，Romero-Carmona R，et al.Sex hormone binding globulin in gestational diabetes［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2000，79（10）：839-845.

［10］Thadhani R，Wolf M，Hsu-Blatman K，et al.First-trimester sex hormone binding globulin and subsequent gestational diabetes mellitus［J］.Am J Obstet Gynecol，2003，189（1）：171-176.

［11］Jin Z，Guan X，Gao H，et al.The change in sex hormone binding globulin and the influence by gestational diabetes mellitus in fetal period［J］.Gynecol Endocrinol，2009，25（10）：647-652.

［12］金镇，王娉婷，王晓岩，等.早孕时血清SHBG水平与妊娠期糖尿病发病的关系［J］.中国妇幼保健，2010，25（28）：4113-4115.

［13］Queipo G，Deas M，Arranz C，et al.Sex hormone-binding globulin stimulates chorionic gonadotrophin secretion from human cytotrophoblasts in culture［J］.Hum Reprod，1998，13（5）：1368-1373.

（编辑裘孝琦，英文编辑刘宝林）

Expression Changes of Sex Hormone Binding Globulin in GDM Placental Tissue and Its Significance

JIN Zhen1，SUN Lei1，TENG Wei-ping2，ZHANG Ya-nan1，AI Wan-ting1，WANG Pin-ting2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004；2.Liaoning Provincial Key Laboratory of Endocrine Diseases，Shenyang 110001）

ObjectiveTo explore expression changes of sex hormone binding globulin in GDM placental tissue and its significance.MethodsDetectingSHBGmRNA，SHBG protein and SHBG concentration in GDM placental tissue respectively used RT-PCR，the Western blot and ELISA.ResultsGDM group compared with controls：SHBGmRNA（1.839±0.827vs 2.485±1.950），SHBG protein（1.852±0.645vs 2.522±0.842）and SHBG concentration（2.071±0.417vs 2.495±0.529）were significantly reduced（P<0.05）.ConclusionSHBG exist in GDM placental nourish cells but its synthesis and secretion were reduced.This played an important role in the pathogenesis of GDM.

sex hormone binding globulin；gestational diabetes mellitus；placenta

R714.25

A

0258-4646（2011）05-0446-03

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1814.013

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1814.013.html

辽宁省自然科学基金项目（20042089）；辽宁省教育厅高校科研计划（20062013）

金镇（1963-），男，教授，博士.E-mail：jinzhen66@yahoo.com.cn

2010-12-30

网络出版时间：2011-05-1815：25