肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定

岳盈盈，李志会，李 鹏，宋楠楠，赵元昊，孟 红

(山东省医学科学院基础医学研究所，山东省罕少见病重点实验室，济南250062)

手足口病(HFMD)是全球性传染病。引起HFMD的肠道病毒有20多种(型)，以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16最为常见;其中EV71引起的HFMD最为严重，可引起心肌炎、肺水肿、脑膜脑炎、脊髓灰质炎样瘫痪等并发症［1］，病死率高。目前临床对EV71感染以对症治疗为主，尚无有效的抗病毒药物。研制安全有效的疫苗和早期诊断试剂盒是防控EV71感染的当务之急。2010年2月，我们采用大肠杆菌表达系统对EV71 VP1蛋白的第2-274aa进行表达及鉴定，并对其表达条件进行优化，旨在为EV71疫苗的研究和检测试剂盒的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 RD细胞由山东省疾控中心赠送;EV71病毒株、E.coli TOP10、PET30a(+)为本室保存; Transetta(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司;pMD18-T载体、限制性内切酶及蛋白酶购自大连宝生物工程公司;1640培养基购自GIBCO公司; D2000 DNA marker、Taq酶、RNA提取试剂盒、质粒纯化试剂盒及DNA凝胶电泳回收试剂盒购自北京泰天河生物技术有限公司;其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 目的基因选择及引物设计 查阅Genbank中VP1基因序列设计引物，在上游引物5'端引入NdeⅠ酶切位点(CATATG)，下游引物5'端引入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，序列如下:EVPLS(上游):5＇-GGAATTCCATATGGATAGGGTGGCAGATGTAAT-3＇; EVPLA(下游):5＇-CCGCTCGAGGTTGGCTTTGAAT-AGGTAGTT-3＇。引物由北京博尚生物技术有限公司合成。

1.3 EV71总RNA提取及目的基因扩增 常规培养RD细胞，待细胞生长成单层后以感染复数量(M.O.I)＞5的 EV71接种细胞，待细胞病变达90%时收获。弃培养上清，RNA提取试剂盒提取RNA并以其为模板进行反转录，体系为20 μl，混匀后置37℃、60 min。PCR反应体系为25 μl，反应条件为94℃预变性3 min，94℃、30 s，45℃、30 s，72℃、30 s，32个循环;72℃延伸10 min。取扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，DNA凝胶电泳回收试剂盒回收目的带。

1.4 表达载体pET30a(+)-VP1构建 将上述回收片段连接于pMD18-T载体，转化TOP10感受态菌株，提取质粒做NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定并委托北京博尚生物技术有限公司测序。将片段与经相同双酶切的 pET30a(+)质粒连接、转化 Transetta (DE3)感受态菌株。用PCR方法进行鉴定。

1.5 目的蛋白鉴定 挑取PCR鉴定阳性菌落接种于5 ml LB培养液中，37℃剧烈震荡培养16 h，以1∶100转接于新鲜LB培养液中，37℃剧烈震荡培养至A600约为0.8，加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)继续37℃剧烈震荡培养4 h，取1 ml菌液，4 000 rpm离心10 min收集菌体，加入去离子水和2×SDS蛋白凝胶加样缓冲液各100 μl重悬，煮沸10 min，12 000 rpm离心10 min。取上清液20 μl与蛋白Marker同时行SDSPAGE电泳，用考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色后观察有无目的条带。

1.6 重组蛋白表达鉴定 采用Western Blot法。十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)后，电转移至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉封闭，先后加临床阳性血清、羊抗人IgM-HRP，反应条件均为37℃、2 h。洗膜后以DAB显色，出现棕色条带者判为阳性。

1.7 重组蛋白表达条件优化 分别在20、30和37℃下，采用浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/ L的IPTG，对目的蛋白进行1、2、4、6 h的诱导表达。取样进行SDS-PAGE电泳，用Bandscan软件分析表达蛋白占总蛋白的百分比，根据结果确定重组蛋白的最佳表达条件。

2 结果

2.1 目的基因扩增 RT-PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，在857 bp处获得特异性条带，与预期目的基因VP1蛋白的同源率均在99%以上，与2008年的安徽阜阳分离株相同区段的VP1蛋白氨基酸序因大小一致(图1)。测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对，与大部分EV71列(GenBank: ACD63039)的同源率为100%。

2.2 表达载体pET30a(+)-VP1的构建与鉴定

重组质粒pET30a(+)-VP1经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在831 bp、5 422 bp获得电泳带，大小与VP1及载体片段长度一致(图2)。

2.3 目的蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳 SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，含重组质粒的诱导菌在相对分子质量约为30 kD处出现一强蛋白条带，而空载体菌在相应位置未出现该蛋白条带(图3)。

2.4 重组蛋白Western Bolt鉴定 以阳性血清为一抗，羊抗人IgM为二抗进行Western blot，结果显示表达的融合蛋白在30kD处出现阳性条带，而空载体菌对照与阳性血清无反应(图4)。

2.5 重组蛋白表达优化条件 在37℃，采用浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h效果最好。

3 讨论

20世纪90年代开始，EV71在亚太地区的流行有上升趋势。进入2009年以后，除西藏外，我国30个省份均有病例发生，主要集中于河南、山东、江苏、广西、安徽等省，危重病例较往年增加。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接。其中VP1被认为有着最多的抗原决定簇［2］，是主要的病毒中和决定因子，直接决定病毒的抗原性，在疫苗研发和诊断试剂盒开发方面有广泛的应用前景。

目前已经有相当多的研究证实了VP1蛋白作为抗原用于诊断和疫苗预防的有效性。Foo等［3］仅利用VP1蛋白上的一段多肽序列就在小鼠模型中观察到了良好的免疫保护反应。Chen等［4］构建了能够表达VP1的转基因番茄，小鼠口服后血清中检测到了EV71的特异性抗体。Chen HL和他的研究小组［5］则通过制备转基因小鼠的方式使重组VP1蛋白出现在母鼠的乳汁中，动物进食这种乳汁可产生有效的免疫保护反应。Chiu等［6］采用减毒的鼠疫沙门氏菌展示表达了VP1蛋白并将其作为疫苗，其免疫保护作用在小鼠模型的实验中得到了证实。本研究选择EV71结构蛋白VP1第2-274aa在大肠杆菌表达系统中进行克隆表达并对其抗原性进行初步鉴定，进而确定蛋白表达的最佳条件为30℃、0.6 mmol/L IPTG，诱导表达4 h。

本研究成功表达并鉴定了EV71 VP1抗原;为EV71疫苗研制及检测试剂盒的建立奠定了基础。

［1］Ishimaru Y，Nakano S，Yamaoka K，et al.Outbreaks of hand，foot，and mouth disease by enterovirus 71.High incidence of complication disorders of central nervous system［J］.Arch Dis Child，1980，55 (8):583-588.

［2］Shih SR，Li YS，Chiou CC，et al.Expression of capsid［correction of caspid］protein VP1 for use as antigen for the diagnosis of enterovirus 71 infection［J］.J Med Virol，2000，61(2):228-234.

［3］Foo DG，Alonso S，Chow VT，et al.Passive protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by neutralizing antibodies elicited by a synthetic peptide［J］.Microbes Infect，2007，9 (11):1299-1306.

［4］Chen HF，Chang MH，Chiang BL，et al.Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71［J］.Vaccine，2006，24(15):2944-2951.

［5］Chen HL，Huang JY，Chu TW，et al.Expression of VP1 protein in the milk of transgenic mice:a potential oral vaccine protects against enterovirus 71 infection［J］.Vaccine，2008，26(23):2882-2889.

［6］Chiu CH，Chu C，He CC，et al.Protection of neonatal mice from lethal enterovirus 71 infection by maternal immunization with attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing VP1 of enterovirus 71［J］.Microbes Infect，2006，8(7):1671-1678.