光合细菌产类胡萝卜素的条件研究与制备＊

郭 丹,孙藜玮

(烟台职业学院,山东 烟台 264670)

0 引言

类胡萝卜素是一类具有特殊功能的天然色素的总称,广泛存在于自然界的动物、植物、真菌、藻类和细菌中。类胡萝卜素的抗氧化作用,远远高于维生素E和维生素C,成为受国际药物、膳食补充剂、功能食品界等广泛关注的新型抗氧化活性物质,被誉为21世纪抗氧化剂时代的“新贵”[1]。

目前提取类胡萝卜素的途径很多,其中最常用的有两种:一是用培养盐藻来提取类胡萝卜素,这种方法需要在高盐份的海域环境,所以只能在少数地区养殖,生产的局限性很大,不宜大范围推广;二是用微生物发酵法生产类胡萝卜素,目前能够发酵产生类胡萝卜素的微生物主要有真菌、细菌和酵母菌等[2-3]。

光合细菌(Photosynthetic bacteria)是生产类胡萝卜素的主要微生物,因其生产周期短,不受季节限制,而且菌体含有丰富的蛋白质,色素提取后的残留物可用作饵料、饲料等而备受科学工作者的重视。为了便于光合细菌中类胡萝卜素的大规模开发和利用,本文将对光合细菌的生长条件及所得类胡萝卜素制品的性质进行研究[4-5]。

1 培养基的配制[6]

1.1 RCVBN培养基(固体/液体):

无机盐溶液 10%

微量元素溶液 0.1%

生长因子溶液 0.1%

20%DL-苹果酸溶液 2%

20%(NH4)2SO4溶液 0.5%

磷酸缓冲液 1.5%

p H 6.8

121℃灭菌 20分钟

(1)无机盐溶液(1000m l)

M gSO4·7H2O 2.0g

CaCl2·2H2O 0.75g

FeSO4·7H2O 0.12g

EDTA 0.2g

p H 6.8

(2)微量元素溶液(250m l)

H3BO30.7g

M nSO4·H2O 0.398g

NaMoO40.188g

ZnSO4·7H2O 0.06g

Ca(NO3)2·3H2O 0.01g

p H 6.8

(3)磷酸缓冲液(1000 m l)

KH2PO440g;

K2HPO460g。

(4)生长因子溶液(100m l)

生物素 1.5mg;

盐酸硫胺素 100mg;

尼克酸 100mg;

对氨基苯甲酸 100mg;

p H 6.8。

(5)20%DL-苹果酸溶液(100m l)

20g DL-苹果酸,用约1/3体积12N NaOH调至p H值6.8。

(6)20%(N H4)2SO4溶液(100m l)

20g的(N H4)2SO4溶液以12N NaOH调至p H值6.8。

1.2 乙酸钠乙酸铵培养基

无机盐溶液10%,微量元素溶液0.1%,生长因子溶液0.1%,磷酸缓冲液1.5%(以上溶液的配制同RCVBN培养基),乙酸钠1g,乙酸铵1g,蒸馏水1L,p H=6.8,121℃灭菌20min。

1.3 乙酸盐培养基

乙酸钠2g,KH2PO40.5g,K2HPO40.5g,M gSO4·7H2O 0.2g,CaCl20.14g,NH4Cl 0.8g,NaCl 0.1g,酵母膏0.5g,水1L,p H=7.0,121℃灭菌20min。

1.4 YP培养基

蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl 5g,p H=6.8,121℃灭菌20m in。

2 菌种培养

2.1 菌种活化

取冰箱冷藏菌种在 YP培养基平板上划线,25-28℃,800lx白炽灯光照培养48小时。

2.2 分离纯化

在YP培养基平板上去红色单菌落重新划线,直至得到纯培养。

2.3 液体种子培养

用RCVBN培养基洗下斜面上的菌苔,液体培养3天。

2.4 液体扩大培养

按10%接种量扩大培养,比较RCVBN、RCVBN-乙酸钠、乙酸盐培养基三种培养基的培养效果。

3 光合细菌培养条件的选择

(1)菌种于30μE/m2·s光照条件下静置培养,接种量分别为10%和25%,定时测定培养液在660nm和485nm处的OD值,以OD660来表示培养液中细菌的生物量,以OD485来表示其中类胡萝卜素的相对含量,描绘细菌的生长曲线。

(2)菌种于30μE/m2·s光照条件下分别进行静置培养和摇瓶培养,检测其生长状况。

(3)菌种分别在6,16,30,40,60μE/m2·s光照条件下静置培养,于24h和48h时测定菌液的光吸收值,分析光照对细菌生长的影响。

4 色素的提取

4.1 收集菌体

6000rpm离心收集培养好的红褐色菌液15min,弃去上清液,用生理盐水洗涤2—3次,得到深红色菌体。

4.2 抽提色素

(1)丙酮:甲醇抽提法[7]

将菌体用丙酮:甲醇(体积比7:2)悬浮,并加入相当于10%甲醇量的 KOH,悬浮液总量约20m l/1.5g菌体,加入索氏提取器进行减压加热(60℃水浴),回馏2h以上。

加入少量无水硫酸钠振荡,-20℃静置后,取出上清液,7000—8000rpm离心去除菌体和蛋白质,减压蒸馏,得到色素粗制品粉末,-20℃过夜。

将粗制品溶于少量石油醚中,加入等体积的甲醇,室温下放置1—2h,去除下层甲醇后,上层用5% NaCl溶液洗涤3次,于40℃下减压抽干石油醚,即得类胡萝卜素精制品。

(2)石油醚:甲醇抽提法

用石油醚:甲醇(体积比2:1)悬浮菌体,加10%甲醇量的KOH,20 m l悬浮液/1.5 g菌体,加入索氏抽提器加热回馏2—3h,蒸出大量石油醚和少量甲醇,直到回馏明显减弱为止。

加入少量无水硫酸钠于抽提液中,-20℃放置后,观察到抽提液分两层,上层墨绿,下层浅绿为菌体、蛋白质和甲醇抽提液。

加石油醚于抽提液中,振荡充分,静置使其分层;若分层不明显,可依次加入甲醇和水,振荡后静置分层。取出上层石油醚,将下层溶液再用石油醚抽提,重复2—3次,直至石油醚层颜色基本消失,将石油醚溶液依次用甲醇和水洗涤2—3次。最后,减压抽干石油醚,即得产品。

5 结果分析与讨论

5.1 培养条件对菌种生长和色素形成的影响

(1)由图1,2,3可以看出,菌种延缓期长短与接种量有很大的影响,二者成反比,而微好氧的摇瓶培养可缩短延迟期,使菌体很快繁殖,达到稳定期,因为在有氧条件下,菌体可进行 TCA循环,代谢较快,一般摇床培养28小时即可,而静置培养须40小时以上。由于类胡萝卜素的生成随光照强度增加而降低,因此光照不宜过强,且菌体在光照3000lx下产量并不具有优势,只是在光照强度提高时,有助于菌体迅速达到稳定期,因此光照以1500lx左右为佳。

图1 光合细菌的生长曲线及类胡萝卜素的产生

图2 光照对细菌生长的影响

图3 静置培养与摇瓶培养的比较

(2)由三种培养基:乙酸盐培养基、RCVBN培养基、乙酸钠乙酸铵培养基比较可见,在乙酸钠乙酸铵和RCVBN培养基中菌体生长旺盛,乙酸盐培养基中菌体含量很少,但很容易收集;RCVBN培养基中由于缺乏乙酸盐或丙酸盐等抑制杂菌生长的成分,培养基中有大量白色杂菌形成的菌团悬浮,表面有白色菌膜,易于污染杂菌;并且RCVBN培养液离心时的菌体沉淀效果远不如乙酸盐和乙酸铵培养基,前者离心时转速以8000—10000 rpm效果为佳,而后二者在转速4000 rpm时菌体沉淀的效果就较为彻底;再者, RCVBN培养基中以苹果酸为碳源,苹果酸价格昂贵,不宜于大规模使用。

光合细菌体积小,收集菌体过程中的动力消耗很大,而某些可以自然沉降的菌株又不能充分利用培养基,繁殖缓慢,菌体含量少。因此,便于收集菌体的价格低廉的培养基对于简化生产工艺,降低生产成本,大规模生产类胡萝卜素具有重要意义。

(3)使用乙酸钠乙酸铵培养基培养菌株时,4000 rpm离心15分钟后,用两种不同的色素抽提方法提取类胡萝卜素。

5.2 色素提取的结果分析

(1)菌体用丙酮:甲醇提取时,二者均可破坏细胞膜,使细胞破裂,而丙酮对类胡萝卜素的抽提有利,甲醇有利于叶绿素的提取;抽提后加入无水硫酸钠可以出去抽提物中的蛋白质等极性物质;10%的甲醇量的KOH是起皂化作用,除去油脂类;最后用甲醇洗去石油醚中的残余叶绿素,加入可促进石油醚和甲醇分层。

(2)类胡萝卜素的经典抽提方法多采用丙酮:甲醇抽提,与石油醚:甲醇抽提法相比,有以下问题:

A.由于石油醚和甲醇不相溶,抽提后可以直接将二者进行分离,不须像丙酮那样,抽提时需要蒸干抽提液,大大简化了操作程序。

B.石油醚沸点低于丙酮,抽提方便,减压抽干时也迅速,抽提温度、时间与丙酮:甲醇抽提法相比,对色素的破坏也较轻。

C.石油醚不溶于水,可以轻易除去色素的石油醚溶液中的水分,易于抽提和减压蒸馏,而丙酮则溶于水,抽提前需要先干燥菌体,否则将会因所含有的水分难以抽干。

D.在使用石油醚抽提法时应注意:由于石油醚不能使细胞变性、破碎,因此最好加大甲醇的用量。

(3)最终得到的色素石油醚溶液中,如果漂浮有白色絮状蛋白质等杂物,可用水洗涤除去,而溶液中的少量水珠需仔细除净,以免影响减压抽干。

(4)石油醚:甲醇抽提法所得类胡萝卜素产量可达 170mg/L培养液,而丙酮:甲醇抽提法只有71.2mg/L培养液。

6 结论

(1)对光合细菌的培养条件进行研究后,发现适当增加菌种的接种量和光照强度、以及好氧培养,均会提高光合细菌的生长速度。

(2)采用石油醚-甲醇抽提法对菌体中的类胡萝卜素进行提取,最终获得的类胡萝卜素产量为170mg/L培养液,菌体湿重为7.5g/L培养液;而丙酮:甲醇抽提法只有71.2mg/L培养液。

[1]尤新.类胡萝卜素功能和国际发展动向[J].中国食品质量报,2009,18(10):62-24.

[2]沈国鹏,徐贵敏,刘芳.脂溶性类胡萝卜素的提取及其稳定性研究[J].河南农业科学,2003,(8):21-23.

[3]曾宇,秦松,梁明山.光合细菌综合应用新进展[J].水产科学,2000,19(5):34-36.

[4]杨丽飞,邓宇.光合细菌在色素提取中的应用[J].中国食品添加剂,2003,(6):93-95.

[5]刘扬,钱新民,高培基.应用均匀设计方法改进光合细菌类胡萝卜素生产[J].山东大学学报,2004,24(1):65-68.

[6]陈德明.光合细菌产类胡萝卜素条件优化及其稳定性研究[D].南京:南京农业大学,2007.

[7]李勤生,王若雪.光合细菌 H-3菌株色素分析[J].水产生物学报,2003,4(4):44-46.