液相色谱-同位素稀释质谱法准确测定人血清中葡萄糖含量

申玉星,全 灿,马 康

(1.广州市计量检测技术研究院,广东广州 510030;2.中国计量科学研究院化学所,北京 100013)

液相色谱-同位素稀释质谱法准确测定人血清中葡萄糖含量

申玉星1,全 灿2,马 康2

(1.广州市计量检测技术研究院,广东广州 510030;2.中国计量科学研究院化学所,北京 100013)

以D-[13C6]葡萄糖标记物作为内标,用高效液相色谱-串联质谱法测定血清中的葡萄糖含量。向室温平衡后的血清样品中加入葡萄糖标记物,用乙醇沉淀蛋白,低温离心去除蛋白,上清液过0.22μm有机滤膜。采用LC/MS电喷雾离子源(ESI),正离子模式,选择离子监测模式进行检测。方法的线性相关系数R2=0.999 5,加标回收率为100.1%～102.8%,检出限为8μg/kg,相对标准偏差0.49%。该方法的样品前处理简单,测定准确高、精密度好,可用于血清中葡萄糖含量的高准确度定值。

液相色谱-串联质谱法;同位素稀释质谱法;血清;葡萄糖

血糖含量测定是临床检验中最重要的指标之一,它可为糖尿病、高血压以及心脑血管系统等疾病的诊断、疗效观察、病程监测、疾病预防等提供客观依据[1]。血清葡萄糖常用的检测方法主要有氧化酶-偶联比色法、微电流法、氧速率法、己糖激酶法、邻甲苯胺法、葡萄糖脱氢酶法、微创测定法和同位素稀释质谱法(IDM S)等[2]。同位素稀释质谱法是微量、痕量和超痕量物质含量的权威测量方法[3]。测定血清中葡萄糖含量的同位素稀释质谱法主要是气相色谱-同位素稀释质谱(GC-IDM S)法和液相色谱-同位素稀释质谱(LC-IDM S)法,前者主要通过沉淀去蛋白后衍生化来进行检测[4-6],样品前处理过程相对复杂,但较LC-IDM S法的研究更加成熟。文献报道主要有正离子模式加Na+、Cs+、N H4+[7-9]和负离子模式加 Cl-、I-[10-11]等。LC-IDMS法去除蛋白后可直接进样检测,不用衍生化,操作简单。采用LC-IDM S法对血清葡萄糖含量高准确度定值的研究尚不够成熟,相关研究报道较少。

本实验在利用 GC-IDM S法准确测定血糖含量的基础上[3,6],研究建立LC-IDM S法定量血糖含量。实验包括配制葡萄糖标准溶液、标记葡萄糖标准溶液以及校准曲线混合溶液,向血清样品中加入D-[13C6]葡萄糖标记物作为内标,乙醇沉淀蛋白后低温离心,利用标准曲线计算,通过LC-IDM S仪测定血清中葡萄糖含量。

1 实验部分

1.1 实验原理

利用LC-IDM S法测定血清中葡萄糖含量,配制葡萄糖标准溶液、标记葡萄糖标准溶液以及校准曲线混合溶液,向血清样品中加入D-[13C6]葡萄糖标记物作为内标,利用乙醇沉淀蛋白后低温离心,取上层清液,过0.22μm有机滤膜进行测定。

1.2 仪器与试剂

1200液相色谱仪,6410串联三重四极杆质谱仪:美国安捷伦公司产品;Xbridge Am ide色谱柱(3.5μm×4.6 mm ×150 mm):美国 Waters公司产品;M ettler Toledo XP26分析天平(最大感量22 g,d=0.001 mg):瑞士梅特勒公司产品;G-560E涡旋振荡器(Scientific Industries);3K15离心机(Sigma);0.22μm针筒式微孔滤膜过滤器。

冰冻混合人血清:由军事医学科学院野战输血研究所提供;D-葡萄糖纯度标准品(纯度为99.5%):美国Sigma公司产品;D-[13C6]葡萄糖标记物(同位素丰度大于99.9%):英国 Cambridge Isotope Laboratories产品;叠氮化钠(分析纯),乙腈(色谱纯):德国 Merck公司产品;无水乙醇(分析纯):美国J.T.Baker公司产品;氨水(分析纯):汕头市西陇化工有限公司产品;醋酸铯(纯度为99%):Acros Organics;实验用水为娃哈哈纯净水。

1.3 样品试样制备

1.3.1 标准溶液、标记葡萄糖标准溶液配制

由于血清样品中没有添加任何抗菌剂,应尽量避免样品接触空气导致微生物引起的葡萄糖含量变化,为此,添加一定体积的0.1%叠氮化钠溶液有助于血清样品的长期储存。精确称量一定质量的纯度标准品,溶入一定体积的叠氮化钠溶液中,浓度的计算应考虑纯度标准品的纯度。精确称量一定质量的标记物纯品D-[13C6]葡萄糖溶入一定体积的叠氮化钠溶液中,标记物溶液在-20℃下冷藏,备用的标记物溶液在4℃冰箱中储存,该溶液在低温下可稳定2周。

1.3.2 校准曲线混合溶液配制 根据血清样品中葡萄糖的大致浓度,用质量法配制。移取100 μL葡萄糖标记物标准溶液(称质量),分别加入不同体积的葡萄糖标准溶液(称质量),配制葡萄糖与标记葡萄糖质量比值分别为0.75、0.85、0.95、1.05、1.15、1.25,轻摇混匀、充分平衡 ,分别加入1 m L无水乙醇,涡旋混匀。

1.3.3 血清样品制备 待血清样品室温平衡后,称取一定质量(100μL)的血清样品,称取前轻摇混匀,且于下层吸取防止吸入气泡。根据血清样品中葡萄糖的大致浓度,向样品中加入100 μL葡萄糖标记物标准溶液(称质量),轻摇平衡。向已添加标记物的样品中加入1 m L无水乙醇[12],振荡混匀,在4 ℃下以5 000 r/min离心10 min除去蛋白,取上层清液,过0.22μm有机滤膜。

1.4 回收率及检出限的测定

取50μL血清样品,添加50μL葡萄糖标准溶液,加入100μL标记葡萄糖标准溶液后按上述处理方法处理,测定回收率。取一定量葡萄糖标准溶液,用无水乙醇稀释,制得0.1 mg/kg葡萄糖样品溶液,以3倍信噪比计算检出限。

1.5 色谱及质谱条件

1.5.1 色谱条件 1)Xbridge Amide色谱柱:3 μm×2.0 mm×150 mm(Waters);流动相:V(乙腈)∶V(水(0.1%NH4OH))=55∶45的混合溶液;流速 0.4 m L/m in;柱温 40 ℃。2)Luna amion色谱柱:3.5μm×4.6 mm ×150 mm(Phenomenex);流动相 :V(乙腈) ∶V(水(40 μmol/L Cs+))=80∶20的混合溶液;流速0.2 mL/min;柱温35℃。3)ZARBOX RX-SIL色谱柱:5μm ×2.1 mm ×150 mm(Agilent);流动相:V(乙腈)∶V(水)=50∶50的混合溶液;流速0.3 m L/min;柱温40 ℃。4)Xbridge Amide色谱柱:3.5μm×4.6 mm×150 mm(Waters);流动相:V(乙腈)∶V(水)=55∶45的混合溶液;流速0.4 m L/m in;柱温40 ℃;进样量5μL。本实验选择最优色谱条件4进行血清样品测定。

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI),正离子模式,干燥气温度 300℃,干燥气流速 10 L/min,雾化气压力 206.7 kPa,毛细管电压3 500V,碎裂电压135 V,驻留时间200 m s。

2 结果与讨论

2.1 色谱与质谱条件的优化

葡萄糖是右旋糖,属D构型,在水溶液中主要以呋喃式构型含氧环存在,为α和β两种构型的衡态混合物。一般用于分离糖类的色谱柱填料,主要为氨基柱或含氨基的聚合物柱,但由于氨基易流失,造成仪器噪声较高,不利于葡萄糖的检测。且葡萄糖的两种构型同时存在,色谱柱分离时易出现双峰,需提高水相比例或升高溶液的p H值进行改善,但提高水相比例不利于分离。本实验优化了色谱柱,选择Xbridge Amide色谱柱,仪器噪声小,灵敏度高,同时优化了流动相比例。葡萄糖经液相色谱质谱正离子模式检测时易加成Na+和NH4+,加成 Na+的准分子不易碎裂,具有较高的灵敏度,但会形成少量的[2M+Na]+,示于图1。提高碎裂电压至135 V时,可有效降低[2M+Na]+的形成,示于图2。

选择加N H4+准分子峰作监测时,一是由于系统中的Na+很难完全去除,干扰加NH4+准分子峰的定量;二是由于一般干燥气温度在300℃以上,加NH4+准分子峰易形成较强的脱水峰和脱氨峰,示于图3。

选择加Cs+准分子峰作监测时,由于Cs+本身为大离子,对温度较敏感,不易形成加成物,只有干燥气在80～100℃时才有较好的信噪比[8],同时也有来自Na+的干扰,示于图4。本实验中未考察负离子模式下加Cl-、I-的准分子作为监测离子的条件。

本实验选择加Na+准分子作为监测离子,并优化了质谱条件,对血清样品进行检测,示于图5～7。由图可以看出,葡萄糖标准品和血清样品中,葡萄糖色谱峰的保留时间为6.1 min,具有较高的灵敏度。

图1 加标葡萄糖标准品在碎裂电压为50 V时的质谱图Fig.1 Mass spectrum of spiked glucose standard in the fragmentor voltage of 50 V

图2 加标葡萄糖标准品在碎裂电压为135 V时的质谱图Fig.2 Mass spectrum of spiked glucose standard in the fragmentor voltage of 135 V

图3 加标葡萄糖标准品选择加NH4+准分子峰作监测时的质谱图Fig.3 Mass spectrum of NH4+attachment

图4 葡萄糖标准品选择加Cs+准分子峰作监测时的质谱图Fig.4 Mass spectrum of Cs+attachment

图5 加标葡萄糖标准品总离子流色谱图(a)和加标血清样品总离子流色谱图(b)Fig.5 TIC of spiked glucose standard(a)and TIC of spiked serum samples(b)

图6 加标血清样品的选择离子色谱图Fig.6 SIM of spiked serum samples

图7 加标血清样品的质谱图Fig.7 Mass spectrum of spiked serum samples

2.2 标准曲线、加标回收率及最低检出限

在葡萄糖标准品与标记葡萄糖标准品质量比为0.75～1.25时,峰面积比和质量比呈良好的线性关系,示于图8。线性相关系数为R2=0.999 5,加标回收率为100.1%～102.8%。以3倍信噪比作为检出限,测得此方法的检出限为8μg/kg。

2.3 血清中葡萄糖含量的测定

取5瓶1#血清样品进行测定,结果列于表1,取3瓶2#血清样品,每瓶取2个平行样,每个样进 2针,取平均值,结果列于表 2。测得1#、2#血糖浓度分别为1 115.9、1 089.1 mg/kg,相对标准偏差分别为0.47%、0.49%。

表1 1#血清样品中葡萄糖含量Table 1 Analytical results of serum glucose 1#(n=5)

表2 2#血清样品中葡萄糖含量Table 2 Analytical results of serum glucose 2#(n=3)

图8 葡萄糖标准品与标记葡萄糖标准品峰面积比与质量比对应的标准曲线Fig.8 The corresponding standard curve of peak area ratio to themass ratio of standard glucose to labeled glucose standard

3 结论

本实验利用液相色谱-同位素稀释质谱法测定血清中葡萄糖的含量,相对标准偏差为0.49%,加标回收率为100.1%～102.8%,检出限为8μg/kg。该方法样品前处理简单,测定准确高、精密度好,可用于血清中葡萄糖含量的高准确度定值。

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Accurate Determination of Serum Glucose by Liquid Chromatography-Isotope Dilution Mass Spectrometry

SHEN Yu-xing1,QUAN Can2,MA Kang2

(1.Guangzhou Institute of Measuring and Testing Technology,Guangzhou 510030,China;2.Division of Metrology in Chemistry,National Institute of Metrology,Beijing 100013,China)

A high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric method w as established for the determination of glucose concentration in serum with the aid of D-[13C6]glucose internal standard.D-[13C6]glucose was added to the serum samp le in balance at room temperature.Then the protein was precipitated and extracted in anhydrous ethanol with centrifugation at low temperature.The supernatant w as filtered through a 0.22μm syringe filter into HPLC vials.Identification was achieved by electro-spray ionization(ESI)in positive mode using SIM mode.The calibration curve of glucose showed good linearity with correlation coefficient ofR2=0.999 5,recoveries of spiked samples were in the range 100.1%to 102.8%,the detection limit of the method was 8μg/kg(S/N=3),and the relative standard derivations were 0.49%.The established method is simple,accurate and precise,is appropriate for the determination of serum glucose with great accuracy.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry;isotope dilution mass spectrometry;serum;glucose

全 灿(1977～),男(汉族),湖南人,博士,副研究员,从事化学计量相关研究。E-mail:superfluidcan@hotmail.com

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0211-05

2010-10-11;

2010-12-21

国家质检总局食品安全专项(21-ASPAQ1101),国家科技支撑计划项目(2009BA K61B02),中国计量科学研究院基础科学研究项目(21-AJDYX1116)资助

申玉星(1981～),男(汉族),山东人,硕士研究生,化学计量专业。E-mail:yxshenoo@163.com