糖尿病大鼠胃动力变化与胃血管变化的关系

张喜娟 严 祥 孙少华 陈 明 尹 红 王 薇 (兰州大学第一医院老年病科，甘肃 兰州 730000)

糖尿病大鼠胃动力变化与胃血管变化的关系

张喜娟 严 祥 孙少华 陈 明 尹 红 王 薇 (兰州大学第一医院老年病科，甘肃 兰州 730000)

目的 研究糖尿病(DM)胃动力变化与胃血管变化的关系。方法 采用高脂高糖饲料喂养诱导并小剂量链脲佐菌素(STZ)注射破坏胰岛β细胞制造DM模型。分别于4 w、24 w时应用单光子发射断层显像仪(SPECT)技术测定胃排空，观察血内皮素(ET-1)、血栓调节蛋白(TM)、血管性假性血友病因子(vWF)，并在显微镜下观察胃血管的病理变化。结果 24 w模型组大鼠血浆TM、vWF、ET-1显著升高，4 w模型组轻度升高。显微镜观察见早期血管内皮轻度损害，微血管代偿性增加，胃动力加快。随着病程进展，血管内皮损害进一步加重，胃黏膜微血管逐渐减少，毛细血管扩张，黏膜下及肌层小血管管壁增厚，管腔狭窄，管壁/管腔比值明显增大，胃动力延缓。结论 DM胃动力变化与胃血管变化相关，微血管变化可能是引起胃动力变化的始动因素。

胃动力;血管;糖尿病;大鼠;内皮细胞

糖尿病(DM)胃排空延迟影响降糖药的药代动力学，使降糖药的吸收迟滞，与进食后血糖的高峰不匹配，造成血糖控制不良，与此同时由于血药浓度高峰的迟滞又可能引起低血糖，造成血糖不稳定。国外资料显示50%的DM患者有胃排空障碍〔1〕。国内外对DM胃动力障碍的研究逐渐增多，但其机制尚不清楚。目前主要认为与神经病变、高血糖、血清胃肠激素异常、微血管病变及代谢紊乱有关，其中血管病变对DM胃动力的影响研究较少。本实验旨在探讨引起DM胃动力变化的原因，研究DM胃动力变化与胃血管变化的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠72只，体重180～200 g，甘肃省中医学院实验动物中心提供。动物饲养在兰州大学基础医学院营养与毒理教研室动物实验室。屏障环境饲养，自由进食饮水。

1.1.2 实验试剂 链脲佐菌素(STZ，美国 Sigma公司);ELISA试剂盒(美国ADL公司);免疫组化试剂盒(武汉博士德公司);DAB显色剂(福建麦新公司);Masson染液(福建麦新公司)、血清胰岛素(FIN)放射免疫检测试剂盒(北京华英生物技术公司)。

1.1.3 实验仪器 多功能时间分辨荧光免疫分析系统(WALLAC VICTOR2-1420，芬兰);以色列针孔型探头单光子发射计算机断层照相仪(SPECT，以色列Elscint Helix公司);稳步倍加型血糖仪(美国强生公司);LX-20型全自动生化分析仪(美国Beckman-coulter公司);U-MDOB3显微镜(日本 OLYMPUS);2510-变频振荡器(上海新波生物技术有限公司);台式恒温隔水培养箱(上海跃进医疗器械厂);Image-proplus多媒体图像分析仪(美国Media Cyber-netics公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胃轻瘫模型的制作 SPF级雄性Wistar大鼠72只，适应性饲养1 w后，随机分为正常对照组(n=24)、实验组(n=48)。两组大鼠自由饮水进食，正常对照组以标准大鼠饲料喂养，实验组大鼠每天以高脂高糖饲料(10.0%猪油﹑20.0%白糖﹑2.5%胆固醇、1%胆酸盐﹑66.5%常规饲料)喂养，连续6 w，每周定时称重一次。喂养6 w后，正常对照组经腹腔注射等量枸橼酸钠缓冲液，实验组经腹腔注射枸橼酸缓冲液配制2%的STZ，剂量为30 mg/kg体重，注射后4 h予50%的葡萄糖水1 ml灌胃。72 h后尾静脉采血测定空腹血糖，以空腹血糖高于16.7mmol/L确定为DM模型建立成功。符合标准的44只。4只不达标者，3 d后补注STZ(以15mg/kg体重剂量腹腔补注)，有3只成模，最终达标的模型动物有47只。造模成功后，不用胰岛素和任何降糖药物控制血糖以普通饲料以及饮食失节法继续饲养，每周测血糖、体重。4 w随机取实验组及对照组各12只用单光子发射断层显像仪(SPECT)测定胃排空，活体心脏采血留取血液后处死，取胃组织及血管标本保存。剩余47只(实验组35只，对照组12只)继续饲养24 w，每2周检测血糖和体重。在此期间自发性恢复1只，因各种并发症死亡6只。模型纳入标准:在胰岛素抵抗基础上，空腹血糖≥16.7 mmol/L。符合模型的28只做核素胃排空测定。

1.2.2 胃排空的检测方法 分别于造模24 w、4 w时采用SPECT技术检测胃排空功能。大鼠禁食8 h、禁水6 h后，应用含有放射性核素标记的半固体食物1 ml(由1 ml纯牛奶与0.5 g面粉配制成糊剂〔2〕)，通过灌胃器缓慢注入胃内之后立即将大鼠仰卧绑缚于特制固定架上，以大鼠腹部为目标区(窗宽20%，矩阵128×128，放大倍数30)，以目标区作为感兴趣区行放射性活性采集，前半小时每5 min采集1次，然后每10 min采集1次，共采集9次，连续测定60 min。通过随机软件，计算出各项指标的校正值及胃的排空曲线。在放射性活性采集期间间断给予乙醚麻醉。A组为DM 24 w(DM-24)，B组为24 w对照组(NC-24)，C组为4 wDM组(DM-4)，D组为4 w对照组(NC-4)。见图1。

1.2.3 取样及指标检测 4 w时随机取DM大鼠及正常对照组大鼠各12只检测空腹血糖，做核素胃排空检测，乙醚麻醉，开胸，心脏取血(6±2)ml，4℃自然凝固后，3 000 r/min离心10 min，取血清，检测FINS、血内皮素(ET-1)、血管性假性血友病因子(vWF)、血栓调节蛋白(TM)、血脂;取全胃，胃组织沿胃大弯剪开用生理盐水冲洗后，展开平铺于固定板固定后放入10%中性甲醛固定液中，于固定1 w内分别取近端和远端大小约0.4 cm ×2.0 cm胃组织，石蜡包埋，检测胃组织血管形态和数据变化;取腹主动脉膈下0.5 cm至肾动脉分叉处以上1 cm处，长(1.4±0.1)cm血管放入10%中性甲醛固定液中，固定后截取0.2 cm血管，剩余的纵向剖开均用伊红标记后石蜡包埋，检测管径/管腔。24 w处理同前。

1.3 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件处理。正态分布的计量资料描述用±s表示。多组间均数比较采用多因素方差分析，计量数据间的相关关系采用多因素逐步回归分析。

2 结果

2.1 胃排空动态变化 各组大鼠胃排空动态变化其中与对照组相比A组胃排空显著减慢，而C组大鼠胃排空显著增快，整个病程中DM胃排空变化呈先加快再逐渐减慢的过程。见表1。

2.2 各组大鼠胃组织血管形态和数量的变化 光镜下HE染色:正常组大鼠胃组织微血管无扩张，管径粗细均一，基底膜厚度正常，间质结构清晰;A组大鼠微血管扩张，基底膜明显增厚，血管内皮肿胀;小血管管径粗细不一，部分血管呈囊样扩张，浆膜层小血管管壁增厚，管腔变形、狭窄，基底膜增厚。C组无明显变化。以胃底浆膜层小血管为统一纳入标准做图像分析。见图2。

表1 各组大鼠胃排空动态变化的比较(±s)

表1 各组大鼠胃排空动态变化的比较(±s)

与同期组相比:1)P＜0.01，2)P＜0.05;与C组比较:3)P＜0.01，4)P ＜0.05，下表同

组别 n 半排时间(min) 排空速率(%) 残留率(55 min)A组 8 79.48±29.831)3) 0.64±0.342)3) 63.10±20.154)B组 12 47.79±13.21 1.13±0.33 46.50±19.00 C组 12 22.62±2.692) 2.20±0.242) 14.22±5.322)D组12 48.76±22.06 1.13±0.39 44.44±19.87

图1 大鼠胃组织血管形态(HE，×200)

图2 A组大鼠胃组织血管与神经(M asson，×200)

光镜下Masson染色:A组小血管周围纤维化。管壁增厚，管壁中膜肌间胶原纤维增生，胶原蛋白交联增多。管腔狭窄，内膜损伤，不完整，部分内皮细胞脱落。并且见胃底浆膜层神经被囊增厚，神经纤维有轻度纤维化。C组无明显变化。见图3。

免疫组化显色:显微镜下血管内皮细胞被染成黄色和黄棕色，以细胞质及细胞核内出现棕黄色着色者为阳性细胞，按文献方法〔3〕以CD34的表达来标记血管内皮细胞，凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管区域的血管均不计数。CD34阳性表达即微血管密度A组低于B组，C组略高于D组，随着病程的进展，胃组织微血管密度呈先增多后减少的趋势，管径/管腔比值A组明显增大，其他组别无明显变化，说明供应胃组织血流的小血管早期并无变化，晚期管壁增厚，管腔狭窄。见表2，图3。

2.4 各组大鼠血管内皮功能、血糖和体重及变化的比较 见表3。DM胃轻瘫组vWF因子高于同期对照组;TM显著高于同期对照组，并且随着病程的发展，血浆TM逐渐增多，与早期糖尿病大鼠比较有统计学意义;血ET-1没有明显变化;血糖明显高于同期对照组，体重随着病程进展逐渐下降。

图3 大鼠胃组织CD34+免疫组化显色(DAB，×200)

表2 各组大鼠胃组织血管数量及管径/管腔比值比较(±s)

表2 各组大鼠胃组织血管数量及管径/管腔比值比较(±s)

组别 n CD34(%) 管径/管腔比值A组 28 2.50±0.211)3) 3.21±0.271)3)B组 12 5.91±0.33 2.01±0.14 C组 12 8.74±0.541) 1.92±0.11 D组12 6.12±0.36 1.86±0.09

表3 各组大鼠血管内皮功能血糖及体重动态变化的比较(±s)

表3 各组大鼠血管内皮功能血糖及体重动态变化的比较(±s)

与同期对照组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05;病程前后比较:3)P＜0.01

组别 n 内皮功能(ng/ml)vWF TM ET-1 血糖(mmol/L)体重(g)A组28 4.61±2.692)3.27±0.691)3)0.49±0.31 18.6±1.221)312±381)3)0±33 B组12 2.35±0.32 1.73±0.41 0.27±0.18 4.0±0.35 392±31 C组12 3.11±0.802) 2.52±0.652)0.35±0.32 21.2±2.941)385±431)D组12 0.93±0.49 1.57±0.52 0.16±0.10 3.7±0.27 28

2.5 胃半排空时间与影响因素的多元逐步回归分析 结果显示与胃排空相关为 CD34(β=0.58，P=0.02)、TM(β=0.53，P=0.04)、vWF(β=0.32，P=0.05)。回归方程的复相关系数R2=0.513。

3 讨论

目前认为糖尿病性胃轻瘫(DGP)与自主神经病变、肠神经系统的病变、高血糖、胃肠激素、幽门螺旋杆菌、微血管病变等有关〔4〕。其中血管病变和DGP的关系较少受到人们的重视。血管病变是2型DM死亡和致残的主要原因，也是许多并发症的基础。内皮细胞损伤是DM血管病变的一个重要原因，也是动脉粥样硬化的早期表现。内皮细胞作为组织与血液之间的防线，是许多疾病发生的主要环节。von Willebrand因子(vWF)被认为是内皮细胞损伤及功能障碍的标志物〔5〕。vWF从血管内皮释放并沉积在基底膜上，与血小板质膜上的受体结合介导血小板黏附于内膜下基质，增加微血栓形成的可能。TM也是血管内皮损伤的一个分子标记物。内皮细胞一旦损伤会造成内皮细胞参与凝血与纤溶能力的改变，从而导致高凝状态，甚至血栓形成。而微血栓形成势必加剧血管内皮细胞的损伤。这些微血管病变正是DM患者肾脏、眼底、神经、肌肉等特征性病变的基础，它在DM及其并发症的发生发展中可能发挥重要作用。

2004年Ceriello教授提出“共同土壤”学说〔5〕认为DM和血管病变有着共同的发病基础-即氧化应激损伤胰岛细胞，同时损伤内皮细胞，导致DM和DM血管病变的发生。本实验通过研究发现DM胃动力障碍和微血管病变有很大的相关性，而且很可能是DGP发病的始动因素。胃微血管变化较胃局部神经变化出现早，胃动力障碍并未发生时微血管变化即存在，早期血管内皮细胞损害，而且微血管代偿性增加，胃动力加快。随着病程进展，血管内皮损害进一步加重，胃黏膜微血管逐渐减少，黏膜下及肌层小血管管壁增厚，管腔狭窄。毛细血管扩张管腔变大。小血管内膜损伤不完整、小血管周围有不同程度纤维化，管壁增厚，管壁肌间胶原纤维增生。早期未见明显的神经变化，整个DM病程中持续高血糖，血糖的波动和胃动力加快减慢未见直接相关性。

1 Talpur N，Echard B，Ingrain C，etal.Effectsof a novel formulation of essential oils on glucose-insulinmetabolism in diabetic and hypertensive rats〔J〕.Diabetes Obes Metab，2005;7(2):1931.

2 刘世雄，严 祥，宋少莉，等.急性心肌梗死大鼠胃排空的变化〔J〕.中华老年医学杂志，2006;25(3):2091.

3 Masaharu T，Hiroyasu I，Miyako B，et al.Attenuation by genistein of sodium chloride enhanced gastric carcinogenesis induced by N-Methyl-NNitro-N-Nitrosoguanidine in Wistar rats〔J〕.Int JCancer，1999;80(2):396-9.

4 王 平.糖尿病胃轻瘫的研究新进展〔J〕.北京医学，2007;29(5):304-5.

5 Ceriello A，Motz E.Is oxidative stress the pathogenicmechanism underlying insulin resistance，diabetes，and cardiovascular disease?The common soil hypothesis revisited〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(5):816-23.

R31;R587

A

1005-9202(2011)12-2260-03

2009年甘肃省医药卫生科研项目(GSWST09-04)

严 祥(1952-)，男，教授，博士生导师，主任医师，主要从事老年医学临床和研究工作。

张喜娟(1981-)，女，在读硕士，主要从事老年医学胃肠动力学研究。

〔2009-12-21收稿 2010-06-11修回〕

(编辑 张永贵/曹梦园)