五味子乙素抗H2 O2诱导PC12细胞凋亡的机制

李先伟 杨解人 (皖南医学院药理学教研室，安徽 芜湖 241001)

五味子乙素抗H2O2诱导PC12细胞凋亡的机制

李先伟 杨解人 (皖南医学院药理学教研室，安徽 芜湖 241001)

目的 探讨五味子乙素(Sch B)抗H2O2诱导PC12细胞凋亡的影响及机制。方法 在H2O2诱导PC12细胞凋亡模型的基础上，采用MTT比色法分析细胞存活率;Hochest33258荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡情况;DCFH-DA法检测细胞内活性氧(ROS)水平;Real Time PCR和Western印迹检测p53基因mRNA和蛋白的表达。结果 不同剂量Sch B处理PC12细胞48 h后，可剂量依赖性对抗H2O2引起的细胞凋亡，提高细胞存活率，减轻H2O2导致的细胞核固缩、聚集和碎裂，降低细胞内ROS的含量，抑制p53基因mRNA和蛋白的表达。结论 Sch B可剂量依赖性对抗H2O2诱导的PC12细胞凋亡，其机制可能与其抗氧化、下调促凋亡基因p53的表达等有关。

五味子乙素;PC12细胞;凋亡;活性氧;p53

五味子乙素(Sch B)是从中药五味子分离得到的有效成分之一，体内外研究表明Sch B具有明显清除自由基和抑制脂质过氧化作用〔1，2〕，提高大鼠脑细胞线粒体抗氧化能力和保护大鼠脑缺血-再灌注损伤〔3〕，但其神经保护作用的机制目前还不清楚。PC12细胞由于其本身的特性常用作神经元模型。本研究采用H2O2诱导PC12细胞凋亡，观察Sch B对凋亡的PC12细胞内活性氧(ROS)含量、细胞周期进程、p53基因表达等方面的影响，探讨Sch B抗H2O2诱导PC12细胞凋亡的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Sch B，纯度98%(成都思科华生物技术有限公司);PC12细胞株(中国科学院上海细胞库);DMEM培养基(北京索莱宝);马血清、胎牛血清(Hyclone);噻唑蓝(MTT);细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、细胞凋亡Hochest33258染色试剂盒、DCFH-DA-ROS检测试剂盒(杭州碧云天);Power SYBR Green PCR Master Mix(大连宝生物工程有限公司)，引物由上海生物工程有限公司合成;山羊抗鼠p53(一抗)、辣根过氧化物酶(HRP)抗羊(二抗)(Santa Cruz)、增强型化学发光试剂(ECL)显色剂(武汉博士德公司);其余试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及诱导分化 PC12细胞置于含10%马血清、5%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。待生长良好时即细胞均处于对数生长期，且细胞存活率均在95%以上时(一般为细胞传代后的1～2 d)。加神经生成因子(NGF)致终浓度为100μg/L继续培养5～7 d。倒置显微镜下观察细胞形态并计数，分化成为神经元样细胞后，继续进行下一步实验。

1.2.2 实验分组与处理 PC12细胞培养24 h，用不同终浓度的 Sch B(5、10、20、40 μmol/L)预处理 60 min，再加 H2O260μmol/L继续培养48 h，收集细胞进行实验。每次实验均设①正常对照组:予2%马血清、1%胎牛血清培养基;②H2O2刺激组:予2%马血清、1%胎牛血清培养基+H2O2(60μmol/L);③各浓度 Sch B(5、10、20、40 μmol/L)干预组:分别予 Sch B 培养60 min后，再予H2O2(60μmol/L)继续培养48 h。每组设3个平行组。

1.2.3 MTT检测细胞存活率 收集对数期PC12细胞，调整细胞密度为(2×105～5×105)。细胞接种于96孔培养板中，每组设8个平行孔，培养24 h后，按以上分组再处理48 h，终止培养前每孔加入MTT 10μl，继续培养4 h，弃去培养液，加入DMSO 150μl/孔，置摇床上低速振荡10～15 min，酶标仪检测各组细胞在492 nm的OD值，以对照组细胞存活率为100%，计算其他各组细胞存活率。细胞存活率(%)=实验孔OD/对照孔OD×100%。以上实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期 收集对数期PC12细胞，调整细胞密度为(2×105～5×105)。细胞接种于6孔培养板中，培养24 h后，分别加入上述处理因素后继续培养48 h。收集细胞，将细胞制成单细胞悬液，4℃预冷(PBS)洗涤 2次;1 000 r/min离心5 min，弃上清，4℃预冷的70%乙醇固定，4℃过夜;1 000 r/min离心5 min，弃上清，4℃预冷PBS 1 ml重悬细胞，每管细胞加入0.5 m l碘化丙啶(PI)(浓度为50 mg/ml)染色液，37℃避光孵育30 min后即可进行流式细胞分析。以上实验重复3次。

1.2.5 细胞凋亡的细胞核形态学检测 收集对数期PC12细胞，调整细胞后接种于12孔培养板中，培养24 h后，分别加入上述处理因素后继续培养48 h。吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，4℃过夜。用PBS洗两遍后加入0.5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min。去染色液，滴一滴抗荧光淬灭封片液后用荧光显微镜观察并拍照。以上实验重复3次。

1.2.6 细胞内ROS水平检测 PC12细胞接种于12孔培养板中，培养24 h后，分别加入上述处理因素后孵育48 h后进行实验。弃取培养液，PBS洗3次，然后每孔加入10μmol/L的DCFH-DA荧光探针1 ml，37℃避光孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。再加入1 m l含血清培养液，30 min后用流式细胞仪(488 nm激发波长，525 nm发射波长)测定细胞荧光强度，计算ROS的含量。以上实验重复3次。

1.2.7 Real Time PCR检测p53基因mRNA的表达 PC12细胞接种于12孔培养板中，培养24 h后，分别加入上述处理因素孵育48 h后进行实验。用Trizol等试剂提取总RNA后，按照逆转录试剂盒操作步骤进行反转录(RT)反应。所得cDNA在实时荧光定量PCR仪上进行反应。于每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照。将PCR产物做熔解曲线，以证实以上PCR反应产物特异性良好。用7300 System SDS Software相对定量分析数据，统计ΔΔCt值以比较各组mRNA的表达。引物如下:(GAPDH)上游引物:5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAACG-3'，下游引物:5'-CAGCCCTTCCACGATGCCAA-3'，扩增产物517 bp;p53:上游引物:5'-TTTGAGGTTCGTGTTTGTGC-3'，下游引物:5'-CCACGGATCTTAAGGGTGAA-3'，扩增产物 194 bp。

1.2.8 Western印迹检测p53蛋白表达 低温提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。每孔上样50μg蛋白，12%SDS-PAGE分离样品，转膜，封闭，将膜与溶于封闭液中的一抗(兔抗大鼠p53多克隆抗体1∶400)，4℃过夜。洗膜，将膜浸入以1∶2 000稀释的二抗稀释液中，室温孵育1 h。加入ECL试剂，曝光，显影，定影，分析。

1.3 统计学分析 应用SPSS16.0统计软件，数据用±s表示。用单因素方差分析进行统计学处理，组间差异采用Student-Newman-Keuls多重比较t检验。

2 结果

2.1 PC12细胞诱导分化 未分化的PC12细胞呈圆形，细胞透亮，体积较小，经NGF诱导7 d后，可见PC12细胞胞体饱满，胞浆透亮，核仁大而明显，胞体周围有明显折光，立体感强，神经元突起较长，且相互联结成网。表明PC12细胞诱导分化成功，可以用于后续实验。见图1。

图1 PC12细胞诱导分化

2.2 Sch B对H2O2诱导的细胞损伤具有保护作用 H2O2可以明显诱导PC12的损伤，与对照组相比，细胞存活率显著降低(P＜0.05)。而不同浓度Sch B可显著提高PC12细胞存活率，与H2O2组相比(P＜0.05)，且这种保护作用呈明显的剂量依赖性。见表1。

2.3 Sch B对PC12细胞周期的影响 流式细胞术结果显示H2O2(60μmol/L)刺激PC12细胞48 h后，细胞周期中G1期细胞所占百分率较对照组显著增加(P＜0.05)，而S、G2期细胞所占百分率均相应减少(P＜0.05);在此基础上，Sch B处理能使G1期细胞百分率减少和S、G2期期细胞百分率增加(P＜0.05)，并且呈剂量依赖性。见表2。

表1 Sch B对PC12细胞活力、ROS水平、p53 m RNA和蛋白表达的影响(±s，n=10)

表1 Sch B对PC12细胞活力、ROS水平、p53 m RNA和蛋白表达的影响(±s，n=10)

与对照组比较:1)P＜0.05;与H2O2处理组比较:2)P＜0.05

蛋白对照组 － 100.00±0.00 0.78±0.05 0.153±0.01 4.87±0.32组别 剂量(μmol/L) 细胞活力(%) ROS p53 mRNA p53 H2O2组 0 38.05±3.431) 8.71±0.521) 1.284±0.151) 8.89±0.741)Sch B组 5 43.49±4.861)2) 7.46±0.411)2) 1.083±0.111)2) 7.98±0.691)2)Sch B组 10 49.73±5.011)2) 6.04±0.281)2) 0.895±0.091)2) 7.65±0.631)2)Sch B组 20 54.36±5.451)2) 5.45±0.551)2) 0.764±0.081)2) 6.21±0.581)2)Sch B组 40 63.67±5.821)2) 4.49±0.311)2) 0.616±0.071)2) 5.43±0.472)

表2 Sch B对PC12细胞周期的影响(±s，n=6)

表2 Sch B对PC12细胞周期的影响(±s，n=6)

与对照组比较:1)P﹤0.05;与H2O2处理组比较:2)P﹤0.05

组别 剂量(μmol/L)细胞周期比例(%)G1 S G2对照组 － 26.94±2.52 44.64±4.68 30.50±2.17 H2O2 0 73.44±7.841) 15.67±1.571) 10.82±1.291)Sch B 5 64.93±6.751)2) 19.62±2.011)2) 15.50±1.721)2)Sch B 10 53.22±5.481)2) 27.67±2.831)2) 19.23±2.161)2)Sch B 20 44.54±4.961)2) 31.81±3.271)2) 23.75±2.451)2)Sch B 40 28.17±2.892) 43.18±4.542) 28.82±3.022)

2.4 PC12细胞凋亡的细胞核形态学改变 Hoechst 33258是一种亲脂性物质，可跨膜进入细胞与DNA特异性结合，紫外光激发时发出明亮的蓝色荧光。正常细胞核出现弥漫均匀的低密度荧光;凋亡细胞核呈浓染致密的固缩形态或者颗粒状荧光。有图2A可见对照组中正常细胞染色质分布均匀，为弥散均匀的低强度荧光。而H2O2处理组，PC12细胞呈现明显的凋亡特征:大量的细胞核呈致密的固缩状或颗粒状，细胞核聚集或碎裂比较明显，且有少量凋亡小体(图2B)。而Sch B处理组PC12细胞的凋亡程度明显轻于H2O2处理组。随着剂量的增加，凋亡的程度越来越轻(图2C、2D、2E、2F)。

2.5 Sch B对PC12细胞ROS水平的影响 DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成二氯荧光黄(DCFH)。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以知道细胞内ROS的水平。流式细胞仪检测结果显示对照组细胞内荧光强度为0.73±0.078，表明细胞内 ROS水平较低，而H2O2组细胞内荧光强度为8.91±0.778，表明细胞内ROS水平明显升高。而Sch B处理组细胞内荧光强度显著降低(P＜0.05)，并且呈剂量依赖性。见表1。

图2 Sch B作用于PC12细胞后Hoechst33258核染色结果

2.6 Sch B对PC12细胞p53基因mRNA表达的影响 与对照组比较，H2O2处理48 h后，p53 mRNA的表达显著升高(P＜0.05)，提示H2O2能促进PC12细胞p53 mRNA表达。而Sch B可明显抑制p53 mRNA表达(P＜0.05)，抑制效应具有显著的剂量依赖性见表1。目的基因p53和内参基因GAPDH的PCR产物通过熔解曲线分析发现均只有一个峰，说明在该反应条件下，各基因的扩增产物具有特异性。

2.7 Sch B对PC12细胞p53蛋白表达的影响 Western印迹结果显示，与对照组比较，H2O2组p53蛋白条带明显变粗，提示H2O2能促进PC12细胞p53蛋白的表达。用浓度为5、10、20、40μmol/L的Sch B处理48 h后，p53蛋白条带逐渐变细，表明SHC可剂量依赖性的抑制p53蛋白的表达(图3)。图像灰度分析结果显示，随着药物浓度的增加，p53蛋白的表达显著降低见表1。

图3 Sch B对PC12细胞p53蛋白表达的影响

3 讨论

研究表明，大量的氧自由基在体内堆积可引起细胞毒性，造成生物学大分子如脂质、蛋白和DNA的损伤。由于脑神经细胞膜富含多不饱和脂肪酸，其氧代谢率极高，抗氧化能力差，因此脑组织更易遭受自由基的损伤。H2O2是和氧化应激反应密切相关的ROS之一，它易穿过细胞膜与细胞内的金属离子作用产生羟自由(·OH)，攻击细胞内的成分如脂质、蛋白及DNA等，引起广泛的氧化损伤。本实验用H2O2建立神经损伤模型，使PC12细胞暴露于H2O2中，结果显示细胞存活率下降，细胞内ROS显示升高，细胞核固缩、聚集和碎裂。这证实H2O2可以诱导体外培养的PC12细胞发生凋亡。

Sch B是从中药五味子中分离的主要活性成分之一，大量研究表明Sch B具有天然的抗氧化性质〔4〕。研究证实，Sch B能够降低缺血再灌注损伤产生的心肌、脑细胞线粒体脂质过氧化物的含量，改善线粒体膜的流动性，并能够清除自由基〔5〕。Sch B还具有增加肝脏微粒体还原型谷胱甘肽(GSH)和GSH还原酶活性，具有抗氧化作用〔6〕。王蕾等人研究表明Sch B可以有效减轻H2O2对神经细胞的氧化损伤〔7〕。本研究表明，Sch B可剂量依赖性对抗H2O2引起的PC12细胞凋亡，提高细胞存活率，减轻H2O2导致的细胞核固缩、聚集和碎裂，降低细胞内ROS的含量。p53基因是一种最常见的促凋亡基因，可使细胞的增殖停滞于G1期，是细胞周期阻滞和细胞凋亡的关键介质〔8〕。本实验中，H2O2诱导 PC12细胞 ROS含量明显升高，ROS可以引起氧化应激，促使p53基因mRNA和蛋白的表达升高，诱导PC12细胞凋亡。而Sch B可抑制ROS的产生，降低p53基因mRNA和蛋白的表达，减轻PC12细胞的凋亡，起到保护效应。

总之，本实验利用培养PC12细胞，观察了Sch B对H2O2诱导PC12细胞凋亡的影响。结果表明，H2O2可以诱导PC12细胞凋亡，而Sch B能剂量依赖性的抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡，同时抑制p53基因的表达。由于氧化应激引起的神经元凋亡作用可能存在其他复杂的病理机制，Sch B如何作用于p53基因目前还不清楚，而p53基因的表达受多种因素的影响。因此，Sch B下调p53基因mRNA和蛋白的表达，保护神经元的作用机制尚需进一步研究。

1 Wang L，Nishida H，Ogawa Y，et al.Prevention of oxidative injury in PC12 cells by a traditional Chinesemedicine，Shengmai San as a model of an tioxidant-based composite formula〔J〕.Biol Pharm Bull，2003;26(7):1000-4.

2 Ichikawa H，Wang L，Konishi T.Prevention of cerebral oxidative injury by post-ischemic intravenous administration of Shengmai San〔J〕.Am JChin Med，2006;34(4):591-600.

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4 王 蕾，龚慕辛，孔庆利.五味子及有效成分抗氧化作用的实验研究概况〔J〕.中华实用中西医杂志，2005;18(17):920-1.

5 Chen N，Ko M.Schisandrin B-induced glutathione antioxidant response and cardioprotection aremediated by reactive oxidant species production in rat hearts〔J〕.Biol Pharm Bull，2010;33(5):825-29.

6 王文燕，陈建光.五味子的药理作用和开发研究〔J〕.北华大学学报自然科学版，2007;8(2):128-33.

7 王 蕾，唐 勇，黄 山.五味子乙素和五味子醇甲对PC 12细胞氧化损伤的保护作用〔J〕.中国临床康复，2006;10(47):64-7.

8 Hofseth LJ，Hussain SP，Harris CC.P53:25 years after its discovery〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2004;25(4):177-81.

Effects of Schisandrin B on apoptosis of PC12 cells induced by H2O2and itsmechanism

LIXian-W ei，YANG Jie-Ren.
Department of Pharmacology，W annan M edical College，W uhu 241001，Anhui，China

Objective To study the effect of Schisandrin(Sch B)on apoptosis of PC12 cells induced by H2O2and itsmechanism.M ethods Based on themodel of apoptosis of PC12 cells induced by H2O2，cell survival rate was evaluated by MTT assay，and apoptosis was analyzed by Hoechst33258 fluorescence staining and flow cytometer.The DCFH-DA fluorescence stainingwas used to determine the level of reactive oxygen species(ROS)in PC12 cells.The expression ofmRNA and protein for p53 gene were tested by real time PCR and Western blot.Results Treatmentwith different concentration of Sch B(5～40μmol/L)for 48 h increased the survival rate of PC12 cells in a dose-dependent fashion，Sch B prevented the PC12 cells nuclei from shrinkage，condensation and cleavage induced by H2O2.Sch B decreased the level of ROS and the expression of p53 mRNA and p53 protein in the PC12 cells.Conclusions Sch B can prevent apoptosis of PC12 cells by H2O2in a dose-dependent fashion，which is likely related to antioxidation and decreasing p53 gene expression.

Schisandrin B;PC12 cells;Apoptosis;Reactive oxygen species;p53

R392

A

1005-9202(2011)12-2244-04

皖南医学院中青年科研基金项目(No.WK200925)

杨解人(1955-)，女，教授，硕士生导师，主要从事心血管药理学研究。

李先伟(1979-)，男，讲师，在读博士，主要从事心血管药理和分子药理研究。

〔2010-07-15收稿 2011-01-12修回〕

(编辑 袁左鸣/曹梦园)