IL-2联合热疗对SSMC7721细胞周期进程及凋亡的影响

黄 革 陈宏勃 方 卓 (吉林大学第二医院放射线科，吉林 长春 130041)

IL-2联合热疗对SSMC7721细胞周期进程及凋亡的影响

黄 革 陈宏勃 方 卓 (吉林大学第二医院放射线科，吉林 长春 130041)

目的 观察白细胞介素-2(IL-2)联合热疗诱导人肝癌细胞株(SSMC7721细胞)的增殖抑制作用。方法 应用MTT比色法检测不同条件下对SSMC7721细胞的增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞周期进程的变化，荧光显微镜检测细胞凋亡率。结果 单纯热疗组，单纯IL-2组及IL-2联合热疗组对SSMC7721细胞的抑制率分别为18.4%、23.7%和46.7%，与对照组相比差别具有显著性意义。流式细胞仪结果显示G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，细胞凋亡率升高，组间比较差异显著。结论 IL-2联合热疗能显著提高SSMC7721细胞增殖抑制率，诱导SSMC7721细胞G1期向S期细胞转化进程，诱导SSMC7721细胞凋亡。

SMC7721细胞;IL-2;热疗;细胞周期;凋亡

热疗与放疗、化疗显著的协同作用已为人们所公认，热疗与生物治疗联合应用近年来也倍受关注〔1〕。本研究应用人肝癌细胞株SSMC7721细胞为靶点，观察白细胞介素-2(IL-2)联合热疗对其作用机制，旨在为人肝细胞癌治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及试剂 SSMC7721细胞株由吉林省肿瘤研究所惠赠，噻唑蓝(MTT)试剂、RPMI1640培养基购于美国Sigma公司，IL-2、胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 取对数生长期的SSMC7721细胞，调细胞数为2×105/ml，接种于96孔塑料培养板内每孔100μl，当细胞生长达到80%汇合时分组，单纯热疗组43℃ ±0.2℃持续加热40 min，然后移入37℃、5%CO2培养箱内静止培养。单纯IL-2组根据预实验结果，IL-2最适量为1 000 U/ml。联合组在单纯IL-2组基础上再加热43℃ ±0.2℃ 40 min，然后移入37℃ CO2培养箱内静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20μl/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h后，吸弃上清加入二甲基亚砜150μl/孔，震荡10 min，使MTT还原产物完全溶解，于酶标仪570 nm处测量各孔吸光度A值，按下列公式计算SSMC7721细胞增殖抑制率。

SSMC7721细胞抑制率=(1-实验孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100%

1.2.2 流式细胞术 细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔塑料培养板改为25 ml培养瓶进行，培养结束后细胞经0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上机前过40目网，调细胞数为1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测，细胞周期结果以Modiffi2.0软件分析。

1.2.3 荧光染色 细胞培养及分组同1.2.1，培养结束后将荧光染液直接滴入96孔培养板内，荧光染液浓度为吖啶橙(AO)100 μg/ml、溴化乙啶(BB)100 μl等量混合，每孔50 μl，然后在荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件，细胞抑制率t检验，细胞周期组间比较采用F检验。

2 结果

2.1 MTT结果 不同条件对SSMC7721细胞增殖均有影响，与对照组相比差异显著，且联合组效果更显著。见表1。

2.2 流式细胞术结果 不同条件对SSMC7721细胞周期各时相均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，组间比较差异显著。见表2。

表1 不同条件对SSMC7721细胞增殖抑制率的影响(±s)

表1 不同条件对SSMC7721细胞增殖抑制率的影响(±s)

组别 A值 抑制率(%) P值对照组1.52±0.12 － －热疗组 1.24±0.14 18.4% ＜0.01 IL-2组 1.16±0.16 23.7% ＜0.01联合组0.82±0.20 46.7% ＜0.01

表2 不同条件对SSMC7721细胞周期进程影响(±s，%)

表2 不同条件对SSMC7721细胞周期进程影响(±s，%)

与对照组G0/G1比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 G0/G1 S G2/M 凋亡率对照组 31.5±2.1 65.4±3.12) 2.7±1.92)0.8热疗组 43.7±3.91) 39.1±4.72) 17.2±2.42) 12.8 IL-2组 52.4±4.21) 27.2±3.32) 20.1±1.72) 13.6联合组 63.6±3.82) 13.6±2.52) 22.8±3.52)21.4

图1 各组SSMC7721细胞凋亡情况

2.3 荧光染色结果 如图1所示，不同条件对SSMC7721细胞结构均有促凋亡作用。

3 讨论

肝癌是最常见的人类致命性恶性肿瘤，由于发病隐匿，确诊时能够手术切除者仅占10%～20%。因此，以非手术为主的综合治疗已成为肝细胞癌的主要治疗手段〔2〕。热疗因其毒副作用反应低，配合放疗、化疗及生物治疗具有显著的协同作用。

本研究应用IL-2联合热疗体外观察其对SSMC7721细胞增殖抑制作用，MTT结果显示，热疗组，IL-2组及联合组对SSMC7721细胞增殖抑制率为18.4%、23.7%、46.7%，与对照组相比差异具有显著性意义。但联合效果明显，两者合用具有协同作用。因为MTT试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色的甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数目及细胞活化状态呈线性关系。所以，该实验被广泛用于抗肿瘤药物的筛选和细胞毒性实验研究，具有一定的客观性。

流式细胞仪结果显示，热疗组、IL-2组及联合组对SSMC7721细胞周期各时相均有影响，组间比较差异显著，文献〔3〕报道S期细胞对热敏感，受热后损伤严重，可形成多核细胞，分裂后死亡，因而导致S期细胞减少。IL-2主要由CD4+和CD8+T淋巴细胞产生，是免疫应答的重要细胞因子，具有多种生物学功能;可通过热休克蛋白调节肿瘤细胞基因的转录和翻译〔4〕，影响细胞DNA的合成，阻滞细胞周期G1期向S期转化过程，从而使G1期细胞增多，不能进入S期。造成S期细胞减少，根据流式细胞仪结果初步认为IL-2与热疗联合应用既能抑制细胞周期G1期的进程，又能抑制S期细胞，从而使G2期/M期细胞相对增多，而G2期/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应〔6〕。这一点从细胞凋亡率反映更为明显。

此外，本研究应用荧光技术对不同条件下的细胞进行复合染色，BB为菲啶类染料，可嵌入多核苷酸结构，活细胞膜可排斥BB穿透，而凋亡或死亡细胞易穿透，故凋亡细胞被染成黄色，死亡细胞则呈均匀红色;AO可穿透活细胞膜，细胞被染成绿色，通过荧光显微镜极易区别。

综上所述，热疗诱使肿瘤细胞产生大量热休克蛋白，具有直接的细胞毒作用，改变细胞膜的通透性和流动性，从而导致细胞内环境发生变化〔6〕，有利于抗肿瘤药物的吸收。所以，热疗与化疗、放疗及生物治疗联合应用具有显著的协同作用。

1 高 慧，杨耀琴.热疗与生物治疗的联合抗肿瘤效应〔J〕.国际肿瘤学杂志，2009;36(3):193-5.

2 宋长城，吕 祥，李 柏，等.抗肝细胞癌血管生成研究进展〔J〕.国际肿瘤学杂志，2007;34(2):128-31.

3 Lim CU，Zhang Y，Fox MH，et al.Cell cycle dependentapoptosis and cell cycle blocks induced by hyperthermia in HL-60 cells〔J〕.Int JHyperthermia，2006;22(1):77-91.

4 Kawauchi K，Ihjima K，Yamada O.IL-2 increases human telomerase reverse transcriptase activity transcriptionally and posttranslationally through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt，heart shock protein 90，and mammalian target of rapamycin in transformed NK cells〔J〕.J Immunol，2005;174(9):5261-9.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like kinase(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells，2000;5(6):491-8.

6 张 威，耿传营，唐劲天.热疗激发肿瘤免疫作用研究进展〔J〕.国际肿瘤学杂志，2008;35(3):166-9.

R739.3

A

1005-9202(2011)12-2237-02

方 卓(1956-)，男，副主任药师，主要从事抗肿瘤药物研究。

黄 革(1967-)，男，主管技师，主要从事肿瘤诊断治疗研究。

〔2011-03-30收稿 2011-04-02修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)