补肾化瘀方对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450表达的影响

杨正望 ，文 炯 ，张增玲

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南醴陵市中医院，湖南 醴陵 412200）

补肾化瘀方对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450表达的影响

杨正望1，文 炯2，张增玲2

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南醴陵市中医院，湖南 醴陵 412200）

目的 观察补肾化瘀方对多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠卵巢颗粒细胞CYP450蛋白表达的影响。方法运用补肾化瘀方对PCOS模型大鼠进行干预后，采用免疫组化法观察卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达。结果 模型组与正常组比较，卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达在表达面积及表达强度上均低于正常组，差异具有统计学意义（P<0.01)；补肾化瘀方中、高、低剂量组及妈富隆组用药后，卵巢颗粒细胞的CYP450的蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05)；其中补肾化瘀方中剂量对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达效果最佳。结论 补肾化瘀方能增强PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达，调节卵巢内分泌失调，改善PCOS高雄血症，逆转卵泡的发育异常，使排卵成功。

补肾化瘀方；补骨脂；菟丝子；泽兰；细胞色素P450芳香化酶；多囊卵巢综合征；大鼠；卵巢颗粒细胞

多囊卵巢综合征 (Polycystic Ovary Syndrome，PCOS)以持续不排卵和高雄激素血症为最根本的特征,临床表现有月经不调、不孕、多毛、肥胖等,发病率约为10%,占不排卵性不孕的50%～70%。有研究表明，芳香化酶可使雄激素转化为雌激素，而在PCOS患者中卵泡睾酮(T)／雌二醇(E2)比值升高，提示其芳香化酶作用的缺陷[1-2]。体内积存过多的雄激素，引起卵泡闭锁，无排卵，形成多囊卵巢（PCO）的一个重要指征。本文通过建立PCOS大鼠动物模型，将补肾化瘀方对其进行干预，采用免疫组化法检测PCOS大鼠卵巢颗粒细胞细胞色素P450芳香化酶（CYP450）蛋白表达的影响，以期发现补肾化瘀方治疗PCOS的作用靶点，为补肾化瘀方治疗PCOS的作用机制提供实验室依据。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 取23日龄（断奶后2 d）SD清洁级雌性大鼠 60 只，体质量（41±42）g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，（合格证号：医动字20-004），清洁级饲养，室温20～26℃，相对湿度40%～70%，噪声小于60 Db。全价营养颗粒饲养，清洁饮用水。

1.1.2 药物 补肾化瘀方：补骨脂12 g，菟丝子12 g，桑寄生 10 g，茺蔚子 15 g，丹参 10 g，泽兰10 g，地龙 10 g，生鸡内金 6 g，甘草 3 g。对照药物：妈富隆，荷兰欧加农公司生产（批号：160445）；丙酸睾酮注射液：天津金耀氨基酸有限公司（批号：050108）；绒毛膜促性腺激素（HCG）：高科华泰制药（批号：0605042）。

1.1.3 试剂 细胞色素P450免疫组化试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司，批号：AR1022）。

1.1.4 仪器 鼠用固定器，眼科解剖器械，医用微波炉，光学显微镜（西德 XDS-1A）；OPTMA56.51图像采集系统（德国Ziess）。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 补肾化瘀方的制备:称取原中药材88 g，用水浸泡后浓煎取汁，由湖南中医药大学药学院药剂实验室统一制备成药物浓度每毫升含生药2.5、5、10 g低、中、高3个不同剂量，分别相当于50 kg成人用药等效剂量2.5、5、10倍。对照药制备：将1片妈富隆溶于50 mL蒸馏水中，按50 kg成人用药等效剂量0.6 mL/100 g灌服。

1.2.2 动物模型制备及分组 按文献[3-4]使用雄激素联合HCG制作大鼠PCOS病理模型，取23日龄（断奶后2 d）SD清洁级雌性大鼠66只，以1∶5分为正常组和造模组，实验组以颈背部皮下注射丙酸睾酮1.25 mg/只，隔日1次，同时给予HCG 1.5 u/只，每天2次皮下注射，连续20 d。造模结束后，正常组和造模组各随机抽取2只大鼠，进行卵巢形态学检测，根据两组囊状卵泡数目及卵巢局部有无黄体形成等，差异是否显著，评定造模是否成功。造模成功后，造模组按随机数字表法随机分为5组：模型组、补肾化瘀方低剂量组（以下简称低剂量组）、补肾化瘀方中剂量组（以下简称中剂量组）、补肾化瘀方高剂量组（以下简称高剂量组）、妈富隆组，每天按时灌服补肾化瘀中药高、中、低剂量和妈富隆，每日1次，给药剂量均以50 kg成人体表面积换算，1 mL/100 g，灌胃21 d后停药7 d，28 d为1个周期，共灌胃观察3个周期。模型组和正常组，每天灌服等量蒸馏水，每日1次。

1.2.3 形态学检测 药物干预3个治疗周期后，各组称体质量，实验过程中，因灌胃操作不当致大鼠死亡3只，实验结束后，大鼠共59只，断头处死后，剖腹，每只大鼠取一侧卵巢组织，4%多聚甲醛固定，HE染色行形态学检查,光学显微镜下观察卵泡及卵巢组织结构。另一侧卵巢组织免疫组化法检测CYP450蛋白表达。实验步骤按照说明进行。

1.2.4 免疫组化法 以细胞浆中出现棕黄色及黄色颗粒为阳性反应。根据染色强度，采用Image-Pro-Plus 5.0图像分析系统，测定卵泡内颗粒细胞的阳性细胞个数、面积及光密度值(棕黄色处)，光密度值大(染色强度强)，则蛋白表达多，反之则表达少。

1.3 统计学分析

所有实验数据输入计算机，采用SPSS for Window 14.0统计软件处理，计量资料数据以 “”表示。采用单因素方差分析 (analysis of variance，ANOVA)进行统计。

2 结果

2.1 补肾化瘀方对大鼠卵巢颗粒细胞CYP450蛋白表达的影响

模型组与正常组比较，大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达在表达面积及表达强度上均低于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。补肾化瘀方中、高、低剂量组及西药组，卵巢颗粒细胞的CYP450表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），说明补肾化瘀方高、中、低剂量组及西药组对CYP450的蛋白表达都具有增强作用。其中补肾化瘀方中剂量对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达效果最佳。见表1～2。

表1 各组大鼠颗粒细胞CYP450蛋白表达密度比较（）

表1 各组大鼠颗粒细胞CYP450蛋白表达密度比较（）

注：与模型组比较 ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与中剂量组比较 *P＜0.05。

组 别 n 药物剂量(g/kg) 阳性细胞个数模型组 10 — 187.2±95.0正常组 9 — 577.8±213.3ΔΔ妈富隆组 10 2.1 391.9±232.4Δ*低剂量组 10 25 390.9±207.8Δ*中剂量组 10 50 577.4±256.6ΔΔ高剂量组 10 100 396.3±178.1Δ

表2 各组大鼠颗粒细胞CYP450蛋白表达强度的比较（）

表2 各组大鼠颗粒细胞CYP450蛋白表达强度的比较（）

注：与模型组比较 ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与中剂量组比较 *P＜0.05。

组 别 n药物剂量(g/kg) 表达面积（μm2） 光密度值模型组 10 — 29.9844±7.5458 0.2017±0.0396正常组 9 — 54.6239±13.2208ΔΔ 0.3113±0.0513ΔΔ妈富隆组 10 2.1 43.2862±14.3542Δ* 0.2632±0.0641Δ*低剂量组 10 25 43.2805±13.4715Δ* 0.2630±0.0584Δ*中剂量组 10 50 54.6180±14.5574ΔΔ 0.3112±0.0571ΔΔ高剂量组 10 100 44.4543±10.6798Δ 0.2708±0.0408ΔΔ

2.2 补肾化瘀方对大鼠卵巢形态学的影响

正常组卵巢色泽红，模型组卵巢表面较苍白，体积增大，见较多囊状扩张的卵泡。补肾化瘀方组卵巢色泽红，未见囊状扩张的卵泡。补肾化瘀方各组颗粒细胞层数明显增加,形态完整,排列整齐,泡膜细胞层明显变薄。光学显微镜下：正常组可见多个不同发育阶段的卵泡,卵母细胞发育正常，胞核与胞质比例适当,透明带完整,颗粒细胞呈多层,形态完整,排列整齐,卵泡膜细胞呈梭形排列；模型组可见卵巢白膜增厚,白膜皮质下见多个卵泡囊性扩张及卵泡闭锁,闭锁卵泡内卵母细胞松散、肿胀,胞核固缩，颗粒层次减少,细胞固缩、坏死,呈深染色团块状,并可见少量中性粒细胞，颗粒细胞胞膜细胞增厚,卵泡腔内胞浆嗜碱性增强；补肾化瘀方干预后的各组则颗粒细胞层数明显增加,形态完整,排列整齐,泡膜细胞层明显变薄。见图1。

图1 补肾化瘀方对大鼠卵巢形态学影响的光镜图（HE染色×100）

3 讨论

细胞色素P450芳香化酶能催化C19雄激素转化为雌激素，是雌激素合成的关键酶之一。CYP450在体内多种雌激素合成部位表达，如卵巢颗粒细胞、脂肪组织和胎盘合体滋养细胞等[5]。已证明P450芳香化酶mRNA在排卵妇女卵巢的排卵前卵泡和所有黄体细胞上均有表达，在卵泡刺激素(FSH)的调控下首先在卵巢颗粒细胞上表达基于卵巢甾体激素分泌的“两种细胞，两种促性腺激素”原理，黄体生成激素(LH)刺激卵泡膜细胞分泌雄激素，FSH影响下在颗粒细胞中雄激素芳香化为雌激素[6]。这种从雄激素向雌激素的转换是随着卵泡在生长成熟过程中芳香化酶活性的增加而改变的。在PCOS患者，由于卵泡发育障碍，颗粒细胞较少，缺乏芳香化酶的活性，FSH的活性阻遏，不能充分将T转化为E2，因此，易导致PCOS患者高雄激素血症。

高雄血症是PCOS患者较为突出的临床特征，与其他临床表现密切相关，治疗中降低雄激素是关键问题。对于伴高雄激素血症的PCOS，补肾药物在治疗中占有十分重要的地位，在促进卵泡发育和排出中疗效肯定[7]。肾虚总有瘀[8]。现代研究已证实：补肾加活血可提高排卵率[9]。

本方由补骨脂、菟丝子、桑寄生、茺蔚子、丹参、泽兰、地龙、生鸡内金、甘草组成。方中补骨脂功能温补肾阳为君药；桑寄生填精补血以滋补冲任之本，菟丝子功能补肾益精，健脾固任，既补肾阳，又滋肾阴，调理冲任，二药共为臣药。三药合用，能使肾阴得养，肾阳得化。生殖之精充足，生殖之力充沛，卵子得以发育成熟。茺蔚子功能活血调经,丹参功能活血化瘀，理气调经，善调妇女经水，为妇科要药。地龙、泽兰走冲任而活血利水，条达气血，冲任通畅，卵子得以顺利排出。生鸡内金可化瘀血，通经络。茺蔚子、丹参、泽兰、地龙、生鸡内金共为佐药，甘草调和诸药为使药。

本实验旨在研究用补肾化瘀方对PCOS大鼠进行干预后，对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450表达的影响，且进一步探讨P450芳香化酶与PCOS卵泡发育的关系。结果表明PCOS大鼠卵巢颗粒细胞存在CYP450蛋白的异常低表达。补肾化瘀方能使PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450蛋白表达水平增强，与正常组接近。提示补肾化瘀方可能通过增强CYP450在PCOS大鼠卵巢的表达，改善高雄激素血症，从而促进卵泡的发育和卵巢的排卵。

[1]FuIghesu A M，Villa P，Pavone V，et a1.The impact of insulin secretion on the ovarian response to exogenous gonadotropins in polyeystic ovary syndrome[J].Clin Endocrinol Metab，1997，82(2)：644-648.

[2]La Marca A， Morgante G， Palumbo M， et a1.Insulin—lowering treatment reduces aromatase activity in response to follicle.stimulating hormone in women with polycystic ovary syndrome[J].Fertil Steril,2002,78(6):1 234-1 239.

[3]Oktay K,Briggs D,Gosden R G.Ontongeny of follicle-stimulating homone receptor gene expression isolate human ovarian[J].Clin Endoerinol Metab,1997,82(11):3 748-3 751.

[4]魏 巍，孙 林，关咏梅，等。睾酮联合绒毛膜促性腺激素建立多囊卵巢大鼠模型的研究[J].中华现代妇产科学杂志，2006，3(1).

[5]Bulun S E， Zeitoun K M， Takayama K， et a1.Estrogen biosynthesis in ensometriosis:molecular basis and clinical relevance[J].M0lEndecrinol,2000,（25）:35-42.

[6]Hunter M，Hjames J,Pharm D S.Polycysfic ovary syndrome:h is not just infertility[J].Am Fam Physic，2000，62(5):1 079-1 090.

[7]冯光荣,尤昭玲.补肾活血法治疗多囊卵巢综合征[J].陕西中医学院学报,2004,27(2):63.

[8]李永莲.补肾需活血探析[J].中医杂志,1996,37(10):585.

[9]章巧萍.浅谈补肾活血法治疗多囊卵巢综合征[J].中国中医药信息杂志，2004,11(11):1 014.

（本文编辑 彭芝配）

Effects of Bushen Huayu decoction on protein expression of CYP450 in ovarian granulosa cells in PCOS rats

YANG Zheng-wang,WEN jiong,ZHANG Zeng-ling
(First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To explore the effects of Bushen Huayu decoction(BHD)on protein expression of CYP450 in ovarian granulosa cells in PCOS rats.Method BHD was used to interpose the rats and the protein expression of CYP450 was determined with immunohistochemical method.Results Compared with normal group, the protein expression of CYP450 in model group was lower(P<0.01);and in high,middle and low dosages of BHD groups and western medicine group were obviously higher(P<0.01 or P<0.05),in which,in middle dosage of BHD group was best.Conclusion BHD can increase the protein expression of CYP450 in PCOS rats,regulate the maladjustment of incretion balance and improve hyperandrogenemia,restore the abnormal growth of folliole and ensure the success of ovulation.

Bushen Huayu decoction;semen psoraleae;semen cuscutae;herba lycopi;aromatase cytochrome P450;polycystic ovary syndrome;rats;ovarian granulosa cells

杨正望(1963-)，女，湖南桃江人，主任医师，教授，医学博士，主要从事中医药治疗多囊卵巢综合征研究。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.008.030.03

2010－09－08

湖南省自然科学基金资助项目(05JJ40027)。