滋阴活血解毒方对局灶性脑缺血模型大鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 含量的影响

段春艳 ，陈 元 ，李定祥 ，邓奕辉 *

（1.湖南中医药大学2008级硕士研究生班，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007）

滋阴活血解毒方对局灶性脑缺血模型大鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 含量的影响

段春艳1，陈 元2，李定祥2，邓奕辉2*

（1.湖南中医药大学2008级硕士研究生班，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007）

目的 观察滋阴活血解毒饮片及超微方对大鼠局灶性脑缺血后白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量的影响。方法 将25只大鼠随机分为假手术组、模型组、滋阴活血解毒方饮片组（以下简称饮片组）、滋阴活血解毒方超微组（以下简称超微组）、阿加曲班组，每组5只。大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血模型，进行神经功能评分。造模成功后7 d，用TTC染色法测定脑梗死范围，用Motic Med6.0数码图像分析系统分析脑梗死面积。采用ELISA法测定大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α的含量。结果 饮片组、超微组及阿加曲班组大鼠脑梗死体积比均明显低于模型组，差异具有统计学意义（P<0.01）；模型组血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量明显高于假手术组（P<0.01），饮片组、超微组、阿加曲班组均能明显降低大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量，与模型组比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 滋阴活血解毒方能减小脑梗死面积，抑制炎性因子的表达，降低脑缺血所致的脑损伤。

滋阴活血解毒方；局灶性脑缺血；脑梗死体积比；IL-1β；IL-8；TNF-α；大鼠；熟地；枸杞；黄芪

缺血性脑血管疾病是目前危害人类健康的首要疾病之一，中医药对脑缺血的治疗有着独特的疗效和优势。既往研究发现，滋阴活血解毒方对糖尿病后脑缺血具有脑保护作用。本次拟在以往研究基础上，以 IL-1β、IL-8、TNF-α、脑梗死体积为观察目标，研究滋阴活血解毒方对大脑中动脉闭塞脑缺血模型大鼠脑损伤的影响。现将实验方法和结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠，SPF级，体质量250～300 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。合格证号：HNASLKJ20100150。

1.1.2 药物 滋阴活血解毒方（由熟地、枸杞子、黄芪、葛根、黄芩、野菊花、蒲公英、地龙、山楂、川芎、水蛭组成）饮片药材从湖南中医药大学附属第一医院购买，经药学院生药学教研室鉴定，超微中药由春光药业公司提供。中药饮片水煎，煎煮2次，每次30 min，2次煎液混匀，超微开水冲溶，均浓缩成每1 mL含生药量1.62 g。阿加曲班，天津药物研究院药业有限责任公司，批号：H20050918。

1.1.3 试剂 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)：国药集团化学试剂有限公司，批号：F20090922；IL-1β、IL-8、TNF-αELISA试剂盒由RD公司提供。

1.1.4 仪器 电热恒温水温箱：型号，HH.W21.CU600，上海跃进医疗器械厂；酶标仪型号：Sunrisebasictecan，瑞士帝肯（TECAN）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药方法 大鼠25只，随机分为模型组、假手术组、滋阴活血解毒方饮片组（简称饮片组）、滋阴活血解毒方超微组（简称超微组）、阿加曲班组,每组各5只。术前1 h开始灌胃给药。每日灌胃、腹腔给药总剂量均按60 kg成年人体表面积换算乘以2计算。滋阴活血解毒方饮片组和超微组

分别灌服滋阴活血解毒方饮片水煎剂、超微水溶剂，每日剂量为2 mL/100 g，阿加曲班组为腹腔注射给药，第 1、2天每日剂量为 1.116 mg/100 g,第 3～7天每日剂量为0.372 mg/100 g。假手术组和脑缺血模型组均灌服等容量生理盐水，每日剂量为2 mL/100 g。分2次给药。造模成功后第7天取脑组织和血标本。

1.2.2 模型制备 采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血大鼠模型。参照Zea Longa E等[1]线栓法。手术操作：10%的水合氯醛，按0.3 mL／100 g腹腔麻醉后，将动物固定于手术台上，取颈正中偏左切口，逐层钝性分离出左侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）和 ICA 旁边一根小分支（翼突腭动脉），结扎颈总动脉、颈内动脉，用动脉夹暂时夹闭翼突腭动脉。在颈总动脉近分叉处上处剪一“v”形切口，阻塞线由“v”形切口插入ICA，直到遇到轻微阻力为止，松开翼突腭动脉上的动脉夹。阻塞线从颈总动脉分叉处算起约长2.0 cm。固定阻塞线，依次关闭切口。假手术组只分离血管，不结扎CCA、ECA及ICA，不插入阻塞线。术中室温保持在25℃，术后大鼠放于饲养盒中，自由饮水、进食并保温。动物于清醒后2 h参照Zea Longa E[1]方法进行神经功能评分，分值在1～3分者入组，余者舍弃，死亡不足动物随机替补。

1.2.3 神经功能评分 参考Zea Longa E方法5分制[1]神经功能评分。0分：无明显神经病学症状；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：向瘫痪侧转圈；3分：行走时向对侧倾倒；4分：不能自发行走。

1.2.4 脑梗死体积测定 动物麻醉后，迅速断头取脑。大脑于-20℃冰箱冷冻15 min后。将大脑放于脑槽中，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，间隔2 mm连续冠状位切片，切5片。将切片加入1%的TTC中，37℃恒温孵育20 min，间断翻动脑片，使均匀接触到染色液。正常脑组织染为深红色，脑梗死区不染色，呈灰白色，再置于4% 多聚甲醛溶液中固定6 h。用Motic Med6.0数码图像分析系统摄像并计算面积。各脑片梗死体积（梗死面积乘以厚度）之和为梗死体积。

脑梗死体积比(%)=V梗死／V全脑×100%

1.2.5 血清IL-1β、IL-8、TNF-α 的测定 动物麻醉后，腹主动脉取血，离心后取血清。-20℃冰箱保存。检测时按照 IL-1β、IL-8、TNF-α 试剂盒方法，经ELISA法测定大鼠血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件，进行方差分析，计量资料以“”表示。

2 结果

2.1 对大鼠神经功能的影响

MCAO术后各模型组大鼠均出现明显的神经功能障碍，模型制备成功。滋阴活血解毒方饮片方组、超微组及阿加曲班组，神经功能障碍逐渐减轻，模型组神经功能障碍无明显改变。假手术组无神经功能障碍现象。

2.2 对各组大鼠脑梗死体积比的影响

假手术组均未出现梗死灶；术后7 d模型组、饮片组、超微组、阿加曲班组均有梗死灶。梗死体积经分析表明：滋阴活血解毒方饮片组、超微组及阿加曲班组脑梗死体积比均明显低于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而饮片组、超微组及阿加曲班组之间，差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见表1。

2.3 对各组大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α 的影响

脑缺血后，模型组和治疗组血清IL-1β、IL-8、TNF-α均增加，和假手术组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，滋阴活血解毒方饮片组、超微组及阿加曲班组IL-1β、IL-8、TNF-α含量均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与超微组比较，饮片组IL-1β、IL-8含量差异无统计学意义（P＞0.05），TNF-α含量饮片组低于超微组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示滋阴活血解毒方和阿加曲班均能降低炎性因子的含量。结果见表1。

表1 对各组大鼠脑梗死体积比和血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 的影响 （n=5，）

表1 对各组大鼠脑梗死体积比和血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 的影响 （n=5，）

注：与假手术组比较▲P＜0.01；与模型组比较△P＜0.01；与超微组比较＃P＜0.05；●为第1～2天给药剂量；●●为3～7 d给药剂量。

组 别模型组假手术组饮片组超微组阿加曲班组药物剂量（g/kg）— —34.2 34.2 11.16×10-3●3.72×10-3●●脑梗体积比（%）12.23±2.53 0 3.47±2.08△2.09±1.69△5.67±3.37△IL-1β（ng/L）56.77±0.76▲24.87±0.63 39.95±0.92△41.53±0.66△36.46±0.77△IL-8（ng/L）532.80±10.98▲350.20±4.66 402.80±11.34△382.20±11.77△393.40±10.01△TNF-α（ng/L）275.80±6.87▲165.20±2.59 172.20±7.94△＃185.80±8.58△176.80±4.02△

3 讨论

脑缺血属于中医学“中风”范畴。在中风的发病机制与治疗上，研究认为其病因为情志失调、饮食不节、精气亏虚、劳倦过度等，是一个本虚标实之证，以肝肾阴虚为本，痰、瘀、风、火为标。《医林改错》曰：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”肾阴不足，化火生热，炼液灼津则为痰，而痰、瘀等诸邪日久亦可化热、化火。痰瘀火热，蕴积不除，毒邪乃生，损伤脑髓。本方用熟地、黄芪、枸杞滋阴益气，以补肝肾之阴。葛根辅以生津。黄芩、野菊花、蒲公英清热解毒。川芎、水蛭、山楂活血行气通络。诸药合用，共奏滋阴活血解毒之功，使祛瘀不伤正，扶正不留瘀。全方具有滋阴、益气、活血、化瘀等功效。既往研究发现，滋阴活血解毒方对糖尿病后脑缺血具有脑保护作用。该方能显著改善糖尿病合并脑梗死患者的临床症状，改善神经功能缺损程度,降低空腹及餐后血糖，降低糖化血清蛋白，降低甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、脂蛋白(a)[LP(a)]，并能有效地缩小颅内血栓病灶[2]。在以人脐静脉内皮细胞株ECV-304为受试对象，以一定浓度的葡萄糖 (Glu)、胰岛素 (Ins)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导体外血管内皮细胞损伤时，滋阴活血解毒中药对Glu、Ins、ox-LDL诱导损伤的血管内皮细胞具有保护作用，而这一作用可能是通过促进内皮细胞的纤溶功能、抑制与炎症反应相关的细胞黏附过程等途径实现的[3]。

滋阴活血解毒方能降低脑缺血模型大鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α 的含量，减小脑梗死体积，降低脑缺血所致的脑损伤。脑缺血初期，在炎性细胞反应之前即可出现炎性细胞因子的表达，如白介素、肿瘤坏死因子等，它们介导缺血损伤时的炎性反应。IL-1是一种炎症和免疫源性细胞因子,既能协同其他细胞因子促进B细胞与T细胞的活化，还能诱导其他炎性介质的产生，黏附分子的表达，白细胞浸润的增加，诱导兴奋性氨基酸和自由基产生,启动多种细胞因子级联反应等[4]。IL-8在神经组织早期炎症反应中，对中性粒细胞具有趋化活性和激活作用，引起中性粒细胞在缺血灶的聚集，造成组织损伤。IL-8还能生成氧化代谢产物，释放细胞内酶，促进神经组织的炎性反应。TNF-α是一种具有多效性作用的促炎细胞因子，在脑缺血后诱发的白细胞浸润和组织损伤中起重要作用,能引起多核白细胞聚集和激活并释放炎症介质,因此如果通过各种措施阻断TNF-α的表达，能减少缺血性神经元损伤[5]。以上这些细胞因子与其他炎性代谢产物共同作用，从而加重脑损伤。

本次拟进一步研究滋阴活血解毒方对脑缺血模型大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量的影响。实验结果表明：在脑缺血后模型组血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量显著升高。给予滋阴活血解毒方药物干预后大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量明显减少，脑梗死灶体积缩小。说明本方能有效抑制炎性因子IL-1β、IL-8、TNF-α 的表达，减少梗死面积，发挥脑保护作用。而超微颗粒作为一种新型中药饮片，保持了传统饮片固有的药效学物质基础，从本实验中考察发现中药超微颗粒与普通饮片功效相同，可替代传统水煎剂。

[1]Zea Longa E,Weinstein P R,Carison S,eta1.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomyin rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]邓奕辉,崔连珠,喻 嵘,等.降糖通脉方治疗糖尿病合并脑梗死32例临床观察[J].湖南中医学院学报，2004，24(5):40-41.

[3]邓奕辉,李定祥,喻 嵘,等.滋阴活血解毒中药对血管内皮细胞损伤的保护作用[J].中国中医药信息杂志,2008,15(6):27-29.

[4]Castellanos M,Castillo J,Garcia M M,et al.Inflammation-mediate damage in progressing lacunar infarctions:a potential therapeutic target[J].Stroke,2002,（33）:982-991.

[5]Benveniste E N.Inflammatory cytokines within the central nervous system:sources,function and mechanism of action[J].Am J physiol,1992,（263）:1-9.

（本文编辑 彭芝配）

Effects of Ziyin Huoxue Jiedu decoction on contents of serum IL-1β,IL-8 and TNF-α in local cerebral infarction in rats

DUAN Chun-yan， CHEN Yuan， LI Ding-xiang， DENG Yi-hui
(TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410007， China)

Objective To observe the differenteffects of traditional Ziyin Huoxue Jiedu decoction and its ultra-micro pieces decoction on the serum contents of IL-1β,IL-8 and TNF-α in rats.Methods 25 rats were randomly divided into the sham-operated,model,traditional Ziyin Huoxue Jiedu decoction(TZHJD),ultra-micro pieces Ziyin Huoxue Jiedu decoction(UZHJD)and Argatroban Injection(AI)groups,5 rats per group.The models were reproduced by occluded middle cerebralartery.The neurologicalfunction were evaluated.Aftermodeling 7 days,the cerebral infarct range was determined by TTC,the cerebral infarct area was analyzied by Motic Med6.0 digital image analysis system,and the serum content of IL-1β,IL-8 and TNF-α were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)methods.Results Compared with model group,infarct volum ratio in all the TZHJC,UZHJD and AI groups were lower（P<0.01）,the content of IL-1β,L-8 and TNF-α in the model group was much higherthan that in the sham-operated group(P＜0.01),while the contents of IL-1β,IL-8 and TNF-α in all the TZHJC,UZHJD and AI groups were lower than that in the model group（P＜0.01）.Conclusion Zinyin Huoxue Jiedu decoction is effective to reduce cerebral infarct size,restrain inflammatory factor expression,and reduce the cerebral injury caused by cerebral ischemia.

Ziyin Huoxue Jiedu decoction;local cerebral ischemia;infarct volume ratio;IL-1β;IL-8;TNF-α;rats;prepared radix rehmanniae;wolfberry;Radix astragali

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.010.036.04

2010－10－28

湖南省科技厅资助项目（2009FJ3140）；湖南省教育厅青年基金项目（08B005）。

段春艳（1982-），女，湖南邵阳人，2008级硕士研究生，主要从事中医药防治脑血管病的研究。

*邓奕辉，女，教授，医学博士，硕士研究生导师，E-mail：dengyihui06@126.com。