麻黄加术汤对大鼠类风湿性关节炎模型作用机制的研究

徐 琦 ，尹抗抗 ，谭达全 ，邓冰湘 *

（1.湖南中医药大学2008级硕士研究生班，湖南 长沙 410007;2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

麻黄加术汤对大鼠类风湿性关节炎模型作用机制的研究

徐 琦1，尹抗抗2，谭达全2，邓冰湘2*

（1.湖南中医药大学2008级硕士研究生班，湖南 长沙 410007;2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的 探讨麻黄加术汤对类风湿性关节炎的作用机制。方法 运用Ⅱ型胶原法建立Wistar大鼠类风湿性关节炎模型，采用麻黄加术汤给予干预，以甲氨喋呤片为阳性对照药。将大鼠随机分为空白组、模型组、甲氨喋呤组、麻黄加术汤组。检测大鼠血清炎性细胞因子IL-1β、TNF-α浓度，观察大鼠膝关节滑膜组织病理改变。结果 麻黄加术汤可显著降低大鼠血清炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的含量，差异具有统计学意义（P＜0.01），对CIA大鼠滑膜组织的炎性细胞浸润、纤维组织增生和巨噬样A型细胞有明显抑制作用，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论 麻黄加术汤治疗类风湿性关节炎的机制可能与降低炎性因子IL-1β、TNF-α的水平，抑制炎性细胞浸润、纤维组织增生和巨噬样A型细胞增生有关。

麻黄加术汤；类风湿性关节炎；IL-1β；TNF-α；滑膜组织；大鼠；麻黄；桂枝；杏仁

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种常见的以关节疼痛、肿胀、僵直、变形为主要表现的慢性全身性自身免疫性疾病，早期表现为关节游走性疼痛和功能障碍，晚期则表现为关节僵硬、畸形，甚至废而不用，具有发病广泛、病程较长、致残率高、不易治愈等特点。在中医学中，RA属于“尪痹”范畴。麻黄加术汤是仲景《金匮要略》中主治“湿家身烦疼”的方剂，本文旨在研究麻黄加术汤对实验大鼠血清IL-1β、TNF-α的调节作用及对实验大鼠膝关节滑膜的影响，进一步探讨该药物治疗类风湿性关节炎的作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar大鼠40只，雌雄各半，4～6周龄，体质量(150±15)g。由湖南中医药大学实验动物中心提供。动物许可证号：scxk（湘）2009-0004。在SPF级实验室饲料喂养。

1.1.2 药物 麻黄加术汤（麻黄、桂枝、炙甘草、杏仁、白术）浓缩煎液，制备成含生药9 g/10 mL的试药，由湖南中医学院第一附属医院制剂科提供；甲氨蝶呤片（MTX）（上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂生产，批号110029）。

1.1.3 试剂 Ⅱ型胶原蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）（sigma公司产品）；IL-1β 试剂盒与 TNF-α 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司产品）。

1.1.4 仪器 天平高速冷冻离心机（CR21型，HITAHI生产）；电子天平（AB204-N意大利生产）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备［1］用0.1 mol/L醋酸溶解Ⅱ型胶原蛋白(2 mg/mL，4℃，过夜)，再与等量的 IFA混合，于冰浴中充分乳化。用生理盐水配置2%戊巴比妥钠麻醉剂，按0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉。用手术剪剪掉尾根部皮毛，75%乙醇消毒。取乳化后大鼠CIA造模剂，除正常组外，按0.4 mL/只于大鼠尾根部、背部、右后肢足趾多点皮内注射。见到局部圆形皮丘肿起，为注射成功。造模后第7天按原方法注射Ⅱ型胶原蛋白0.2 mL/只做加强免疫1次。

1.2.2 动物分组及给药方法 所有动物称体质量，编号后，随机抽取10只（雌雄各半）为空白组，其余动物为造模组。造模组，动物造模后第5周，按体质量分层，随机再分为3组（模型组、甲氨喋呤组、麻黄加术汤组），每组10只。实验第5周开始定时灌胃治疗，甲氨喋呤组给予甲氨喋呤片混悬液灌胃，每周1次，给药剂量均按70 kg成人体表面积换算，大鼠160 g体质量为标准，大鼠和人用药量按单位质量用药量换算系数6.25计算[2]大鼠用药剂量为0.89 mg/kg；麻黄加术汤组动物给予麻黄加术汤灌胃，根据实验大鼠和人用药量按单位重量用药量换算系数计算，确定为18.75 mL/kg；每天1次，空白组和正常组给予等体积蒸馏水灌胃。连续用药4周。

1.2.3 IL-1β，TNFa检测 于末次给药结束后2 h收集标本。在大鼠麻醉后腹主动脉取血，静置30 min 后，离心（2 000 r/min，15 min），取上清，置冰箱中以供检测IL-1β、TNF-α。应用武汉博士德生物工程公司提供的白细胞介素-1β放免药盒和肿瘤坏死因子-α放免药盒测定大鼠血清白细胞介素-1β及肿瘤坏死因子-α。根据说明书中步骤进行操作。在标本中加入分离剂后充分混匀，放室温20 min，4℃离心3 500 r/min 25 min，吸取上清液，用Υ计数器测试放射性。以B/T计算NSB、50结合百分率，以B/BO计算标准及待测样品结合百分率，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值。或由自动Υ计数器预先编制程序，直接给出有关参数、标准曲线及样品浓度。

1.2.4 大鼠膝关节滑膜病理组织切片 完整分离膝关节滑膜组织，用刀片完整切下，以多聚甲醛液固定，脱水，包埋，切片，HE染色。由湖南中医药大学病理实验室协助制作病理切片。按炎性细胞浸润、巨噬A型细胞增生、滑膜增生、纤维组织增生4个方面病理改变，按以下标准分4级进行评价计分[3]：(1)炎性细胞浸润:无炎性细胞浸润为0分，炎性细胞浸润少于20个/高倍视野(HF)为1分，20～50个/HF为2分，大于50个/HF为3分；(2)巨噬A型细胞增生:无巨噬A型细胞增生为0分，少于10个/HF为1分，10～20个/HF为 2分，大于20个/HF为 3分；（3）滑膜增生:滑膜细胞扁平，数量不多为0分，滑膜细胞肿胀，密集单层排列为1分，滑膜细胞肿胀，密集2层排列为2分，滑膜细胞肿胀，密集3层以上排列为3分；(4)纤维组织增生:无纤维组织增生为0分，平均增生少于0.2个/HF为1分，平均增生0.2～0.4个/HF为2分，平均增生大于0.4个/HF为3分。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 麻黄加术汤对大鼠血清中的IL-1β、TNF-α含量的影响

模型组大鼠血清IL-1β与空白组比较明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.01），说明模型组大鼠炎性反应明显。甲氨喋呤组、麻黄加术汤组均可下调大鼠血清中IL-1β含量，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。模型组大鼠血清 TNF-α与空白组比较明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.01），说明模型组大鼠炎性反应明显。甲氨喋呤组、麻黄加术汤组均可下调大鼠血清TNF-α含量，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01），麻黄加术汤组抗炎作用优于甲氨喋呤组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示麻黄加术汤调控相关炎性细胞分泌TNF-α因子的能力最强，能更好的减轻大鼠炎症反应，使关节损伤逐渐减轻。见表1。

表1 麻黄加术汤对CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α 含量的影响 （n=10，ng/mL，）

表1 麻黄加术汤对CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α 含量的影响 （n=10，ng/mL，）

注：与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与甲氨喋呤组比较★P＜0.05。

组 别 剂量（mg/kg） IL-1β TNF-α空白组 — 0.187±0.035△△ 1.354±0.114△模型组 — 0.306±0.049 1.898±0.137甲氨喋呤组 0.89 0.253±0.042△ 1.567±0.108△△麻黄加术汤组 18.75 0.229±0.044△△ 1.458±0.169△△★

2.2 麻黄加术汤、甲氨喋呤对大鼠滑膜组织病理分级的影响

麻黄加术汤组、氨喋呤组与模型组在炎性细胞浸润、巨噬A型细胞增生、滑膜增生、纤维组织增生、总积分5个方面的比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），说明两者均具有改善RA关节滑膜病变的作用。麻黄加术汤组改善RA关节滑膜病变的作用优于甲氨喋呤组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 见表 2。

表2 麻黄加术汤对CIA大鼠滑膜组织病理分级的影响 （n=10，）

表2 麻黄加术汤对CIA大鼠滑膜组织病理分级的影响 （n=10，）

注：与模型组比较△P＜0.05，△△ P＜0.01；与甲氨喋呤组比较★P＜0.05。

组 别 药物剂量（mg/kg） 炎性细胞浸润 巨噬A型细胞增生 滑膜增生 纤维组织增生 总积分空白组 - 0.75±0.45 0.66±0.49 0.58±0.51 1.25±0.62 0.67±1.63模型组 - 2.33±0.78 2.33±0.65 2.41±0.67 2.41±0.51 5.83±1.72甲氨蝶呤组 0.89 1.50±0.90△ 1.50±0.80△ 1.67±0.64△ 1.51±0.90△△ 3.83±1.83△麻黄加术汤组 18.75 1.33±0.89△△ 1.33±0.89△△ 1.50±0.80△△ 1.50±1.00△△ 1.83±1.60△△★

3 讨论

类风湿性关节炎属中医学 “尪痹”的范畴，“尪痹”历代医家称为“历节病 ”又名“鹤膝风”，表现为经久不愈，好发于小关节，主要表现为疼痛、肿胀、僵直、畸形、骨质改变，筋缩肉卷，肢体不能屈伸。本病的病机多为先天不足，后天不济，气血两亏，或病后、产后机体防御能力低下，卫外不固，风寒湿热之邪乘虚而入，痹阻于肌肉、骨节、经络之间，使气血运行不畅导致为痹。麻黄加术汤出自《金匮要略》，为辛温解表剂，其药物组成麻黄（去节9 g）、桂枝（去皮6 g）、炙甘草（3 g）、杏仁（去皮尖 6 g）、白术（12 g），具有发汗解表、散寒祛湿之功效，它不仅可祛除在表的寒湿，亦可祛除在里的寒湿。方中用麻黄祛风以发表，以白术除湿而固里，且麻黄汤内有白术，则虽发汗而不至多汗，而白术得麻黄并可以行表里之湿，即2味足以治病。况又有桂枝和营达卫，助麻黄以发表；杏仁疏肺降气，导白术以宣中；更加甘草协和表里，使行者行，守者守，并行不悖。

类风湿性关节炎(RA)是一种病因不明的自身免疫性疾病，在其发病的过程中，多种细胞因子、感染因子、细胞与体液免疫反应及滑膜增生等因素共同参与其免疫病理损伤过程。TNF-α由滑膜细胞以自分泌和旁分泌的方式表达，可促进前列腺素E2（PGE）等多种炎症介质释放，趋化炎性细胞进入关节滑膜，介导关节滑膜产生持久的炎症反应，并导致关节软骨损害[4]。IL-1β主要由单核／巨噬细胞分泌，与RA活动性和组织形态学特征密切相关，它通过调节多种细胞因子、细胞黏附分子、免疫调节分子及前炎症介质的表达，在RA滑膜肥大、白细胞浸润、骨侵蚀和软骨破坏中发挥重要作用[5]。IL-1β与TNF-α常同时合成和分泌，并且有许多共同的生物学效应。二者称为“姊妹细胞因子”，均是致病机制中居“中心地位”的促炎症细胞因子，参与RA发生、发展的全过程。许多研究证实，患者外周血单核细胞和关节滑膜的巨噬细胞能分泌IL-1β和TNF-α，使外周血和关节滑膜液中的IL-1β和TNF-α含量增高。释放到关节滑膜液及血液中的细胞因子IL-1β与TNF-α有许多相似的生物学活性，不但以自分泌的方式刺激巨噬细胞增加自身的产生，而且也能促进对方的合成[6]。

实验结果显示，麻黄加术汤能降低TNF-α的水平，从而阻断炎症反应，延缓RA的进展，同时降低IL-1β的含量，以遏制炎症的始动因素，减轻RA的破坏作用。麻黄加术汤在CIA大鼠滑膜组织炎症的病理改变过程中有明显的抑制作用，对RA的滑膜炎症有较好的治疗作用。本实验表明麻黄加术汤治疗类风湿性关节炎的机制可能与降低炎性因子IL-1β、TNF-α的水平，抑制炎性细胞浸润、纤维组织增生和巨噬样A型细胞增生有关。此实验为麻黄加术汤临床上治疗RA提供了实验和理论依据。

[1]熊国林，黄海啸，谢 玲，等.类风湿性关节炎大鼠模型的制备［J］.解放军医学杂志，2007，11（7）：1 690－1 691.

[2]徐叔云.药理实验方法学（第3版）[M].北京：人民卫生出版社，2002：1 861.

[3]陈纪藩，黄清春，陈光星，等.通痹灵对CIA大鼠滑膜组织病理改变的影响[J].安徽中医学院学报，2003，22（2）：47-49.

[4]何金华，梁清华，张花先，等.痹肿消汤对实验性关节炎大鼠血浆TNF-α 的影响[J].湖南医科大学学报，2002，27(5)：425.

[5]姚 建.复方苦参注射液对类风湿性关节炎大鼠血清IL-1β、TNF-α 的影响[J].中国中医药科技，2007，14（5）：324-325.

[6]李兴勇.类风湿性关节炎与基质金属蛋白酶的研究进展[J].中国临床康复，2003，11（7）：1 690-1 691.

（本文编辑 彭芝配）

Mmechanism study of Mahuang Jiazhu decoction on rheumatoid arthritis model in rats

XU Qi,YIN Kang-kang,TAN Da-quan,DENG Bing-xiang
(TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410007， China)

Objective To investigate the mechanism of Mahuang Jia zhu decoction on rheumatoid arthritis.Methods The arthritis models of Wistar rats were stablished by the typeⅡcollagen,the decoction was given to be therapeutic drug,and methotrexate tablets was used as a positive control.The rats were randomly divided into control group,model group,methotrexate group,the decoction group.The serum concentration of inflammatory cytokines IL-1β TNF-α,and the synovial tissue pathology in knee joint was measured.Results The decoction significantly reduced the serum levels of inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α content of synovial(P＜0.01),and inhibited significantly the CIA infiltration ofinflammatory cells,fibroustissue hyperplasia and macrophage-like cells-A significantly(P＜0.01).Conclusion The mechanism of the decoction for rheumatoid arthritis maybe related to reduce the inflammatory factor IL-1β and TNF-α levels,inhibit the inflammatory cells infiltration,fibrous tissue hyperplasia and macrophage-like cell proliferation-A.

Mahuang Jiazhu decoction;rheumatoid arthritis;iL-1β;TNF-α;rats;Chinese ephedra;cassia twig;almond

* 邓冰湘，女，教授，博士研究生导师，E-mail：tb.xinleiren@163.net。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.004.013.03

2010－12－12

湖南省科技厅资助项目（2008SK3071）。

徐 琦（1985-），女，湖南沅江人，在读硕士研究生，主要从事中医病机与临床研究。