还少丹对D-半乳糖衰老模型小鼠心肌线粒体DNA缺失的影响

程莉娟，刘群良*，谭 峰，胡 梅，周赛男

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

还少丹对D-半乳糖衰老模型小鼠心肌线粒体DNA缺失的影响

程莉娟，刘群良*，谭 峰，胡 梅，周赛男

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的 探讨还少丹对D-半乳糖(D-gal)诱导的衰老小鼠心肌线粒体DNA（mtDNA）缺失的影响。方法 将40只小鼠随机分为空白对照组、衰老模型组、还少丹低、高剂量组，用D-半乳糖建立衰老模型，分别给予蒸馏水和还少丹水煎液灌胃。连续给药6周后，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增心肌组织mtDNA，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，用光密度扫描定量各组mtDNA的缺失率。结果 空白对照组未见mtDNA缺失型扩增条带，其余各组均出现不同程度的缺失型扩增条带；与模型组比较，低、高剂量组小鼠心肌mtDNA缺失率明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）；而低剂量与高剂量组之间比较mtDNA的缺失率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 还少丹能减少D-半乳糖诱导的衰老小鼠心肌mtDNA的缺失程度，提示该方能降低mtDNA的氧化损伤，保护mtDNA的结构完整性，从分子水平上为还少丹抗衰老的作用机制提供了一定的实验依据。

还少丹；衰老；心肌；线粒体DNA；小鼠；何首乌；熟地；肉苁蓉

线粒体是除细菌、蓝绿藻及哺乳动物的成熟红细胞之外，所有真核细胞均含有的细胞器，它是细胞能量产生与转换的重要场所。线粒体拥有一套自身的遗传控制系统，同时又受到核DNA（nDNA）的调控。随着分子生物学的发展，线粒体在衰老中的作用越来越被人们所认识并引起关注。mtDNA突变不仅可导致器官老化，而且可引发多种老年性疾病[1]。本研究拟采用D-半乳糖衰老氧化损伤模型小鼠，利用PCR技术研究小鼠心肌mtDNA的缺失程度，探讨还少丹延缓衰老的机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级昆明种小鼠，40只，雌性，7月龄，体质量（47.4±4.3）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，合格证号［SCXK（湘）2009-0004］。

1.1.2 药物 还少丹由何首乌、熟地、肉苁蓉等中药组成，购自湖南省药材公司。还少丹水煎液：取310 g中药加800 mL水，煎煮1 h，过滤离心，取滤渣及沉淀加水煎煮1 h后再过滤离心，合并2次滤液，加热浓缩至浓度为1 g／mL（生药），置冰箱4℃冷藏保存备用。

1.1.3 试剂 D-半乳糖为美国Amresco公司产品；蛋白酶K为美国Merck化工技术公司产品；dNTP和Taq酶为大连TaKaRa生物工程有限公司产品；引物为上海博尚生物公司产品；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器 TGL-16高速冷冻离心机（湖南仪器厂）；WD-9402A型PCR扩增仪（北京六一仪器厂）；Champ Gel 5500系列凝胶成像分析仪（北京赛智创业科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将40只雌性小鼠，按体质量随机分为4组，分别为空白对照组、衰老模型组、还少丹低、高剂量组，每组10只。

1.2.2 动物模型的制备及给药方法 在无菌条件下，将D-gal用生理盐水配制成1 g/dl的D-gal溶液，以 100 mg/（kg·d）的剂量，给衰老模型组、还少丹低、高剂量组小鼠颈部皮下注射6周，建立衰老模型。空白对照组颈部皮下注射等量生理盐水；同时，用还少丹水煎液给还少丹低、高剂量组灌胃。小鼠用药剂量按70 kg成人与20 g小鼠体表面积比值换算。低剂量组用还少丹水煎液10 mg/g灌胃（相当于成人剂量的等效剂量），高剂量组用还少丹水煎液20 mg/g灌胃（相当于成人剂量的2倍）。空白组和模型组给予等量的蒸馏水灌胃。每周灌胃5 d，另2 d自由饮药，连续给药6周。

1.2.3 小鼠心肌组织DNA提取 参照文献[2]的方法，小鼠颈椎脱臼法处死，立即取心脏绿豆大小组织，剪碎，加入1 mL细胞裂解液裂解细胞，加入蛋白酶K至终浓度为200μg/mL，室温震荡消化2 h。用酚、氯仿、异戊醇（酚∶氯仿∶异戊醇 25∶24∶1）法，提取心肌组织总DNA，再用无水乙醇沉淀，洗涤纯化，用紫外分光光度法检验提取DNA的质量和浓度。将符合纯度要求的DNA，置-20℃保存备用。

1.2.4 PCR扩增及产物半定量分析 引物设计参照文献[3-5]，扩增小鼠心肌mtDNA最常见的缺失类型—3 867 bp片段的缺失，采用3条引物，各参数见表1。其中L1、H扩增缺失型mtDNA，获得630 bp片段，反映mtDNA的缺失量；L2、H扩增野生型mtDNA，获得468 bp片段，反映正常mtDNA的含量。PCR 反应体系为 20 μL，含 4×dNTP 各 200 μmol/L，引物各 0.25 μmol/L，DNA 模板 0.2μg，Taq 酶 1.5 U。循环条件为：94℃变性45 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30循环；末次延伸7 min。扩增产物20 μL经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶扫描系统拍照，并对野生型mtDNA条带及缺失型mtDNA条带进行积分光密度测定，以缺失型mtDNA量/(缺失型mtDNA量+野生型mtDNA量)的百分比率，反映心肌mtDNA3867bp的缺失程度。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 17.0统计软件统计分析，结果用“”表示，组间比较采用单因素方差分析。

表1 引物设计参数

2 结果

2.1 还少丹对小鼠心肌mtDNA的PCR产物电泳的影响

各组小鼠心肌组织均扩增得到野生型mtDNA 468 bp条带；衰老模型组、还少丹低剂量组和还少丹高剂量组小鼠心肌组织还可见630 bp缺失型mtDNA条带，空白对照组小鼠心肌组织未扩增出缺失型mtDNA条带。见图1。

图1 各组小鼠mtDNA PCR扩增电泳图

2.2 还少丹对小鼠心肌mtDNA缺失率的影响

空白对照组小鼠心肌未见缺失型mtDNA，其余各组经凝胶成像光密度扫描定量分析。与衰老模型组比较，还少丹低、高剂量组小鼠心肌mtDNA缺失程度均明显降低（P<0.05）；还少丹低剂量组和还少丹高剂量组之间mtDNA缺失程度的差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

表2 各组小鼠心肌mtDNA缺失率的比较 （，%）

表2 各组小鼠心肌mtDNA缺失率的比较 （，%）

注：与衰老模型组比较*P<0.05；与还少丹低剂量组比较△P>0.05。

药物剂量 缺失率mtDNA/（mg/g） 总mtDNA光密度比值空白对照组 10 — 0.000 00±0.000 00衰老模型组 10 — 0.032 76±0.003 08还少丹低剂量组 10 10 0.018 79±0.001 19*还少丹高剂量组 10 20 0.020 51±0.000 32*△组 别 n

3 讨论

近年来，众多学者提出线粒体DNA与衰老的关系，认为mtDNA的氧化损伤引起mtDNA突变的累积,可导致能量产生缺陷、衰老和细胞死亡[6]。mtDNA主要功能是与氧化磷酸化有关，哺乳动物的mtDNA具有37个编码基因，包括22个tRNA基因、2个rRNA基因和13个氧化磷酸化相关蛋白基因[7]。由于mtDNA处于高氧自由基环境，且呈裸露状态而缺乏组蛋白的保护，加之损伤修复机制不完善，极易受到氧化损害而发生突变。尽管其突变率非常低，但随个体增龄呈显著性增高趋势[1]。mtDNA突变导致氧化磷酸化功能的改变，可引起细胞的能量代谢障碍，组织器官功能减退，成为生物体衰老的一个重要因素。mtDNA突变主要包括点突变、缺失突变和DNA重排，其中DNA片段的缺失与衰老的关系非常密切，且缺失存在于个体心肌、脑、肝、肾等多种组织中[3-5]。曾昭惠[3]等对小鼠大脑及鼠毛组织mtDNA 3867bp片段缺失的研究证明，老年鼠mtDNA存在该片段的缺失，中青年鼠则无缺失现象。卢健[8]等报道20月龄小鼠心肌mtDNA 3 867 bp的缺失较5月龄小鼠高。由此，许多研究表明，小鼠mtDNA 3 867 bp片段缺失已成为衰老生物学的标志之一。

D-半乳糖衰老模型是国内外公认的衰老造模方法，受到自由基、活性氧等衰老理论的支持。许多学者的研究均已证实，D-半乳糖衰老模型出现多种与自然衰老类似的生化改变，在生物体内出现多系统、多组织、多水平的变化［9］。本研究中衰老模型组mtDNA缺失程度与空白对照组具有显著差别，提示该实验造模成功。

还少丹源于《济阳纲目》，该方具有益精补髓，壮元阳，延年益寿，白发变黑的功效，是中医古籍中记载的补肾抗衰名方。近年来已有研究报道，该方能加快机体内自由基的清除，提高细胞抗氧化的能力，延缓小鼠端粒长度的缩短[10-11]。本研究证明，还少丹能有效地降低D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠心肌mtDNA 3 867 bp片段的缺失率，提示该方能降低心肌mtDNA的氧化损伤，保护心肌mtDNA的结构完整性，从分子水平上论证了补肾抗衰的作用机制。

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（本文编辑 彭芝配）

Effect of Huanshaodan on deletion of myocardial mitochondrial DNA induced by D-gal in aged mice

CHENG Li-juan,LIU Qun-liang,TAN Feng,HU Mei,ZHOPU Sai-nan
（TCM Univerity of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China）

Objective To investigate the effect of Huanshaodan on deletionof myocardial mitochondrial DNA induced by D -gal in aged mice. Methods Forty micewere divided randomly into blank control group, aged model group, low dose groupand high dose group. The models were established by injecting D-gal and feed with distilledwater and Huanshaodan decoction respectively 6 weeks. The polymerase chain reaction(PCR) wasused to amplified the myocardial mitochondrial DNA. The agarose gel electrophoresis andlight density scanning were used respectively to detect the products of PCR and ratioof mtDNA deletion. Results The mtDNA deletion products were not in bland control group butin all other groups in some degrees. Compared with model group, the mtDNA deletion inboth dose groups were significant (P<0.05)but difference between the low dose groupand high dose group not obvious (P>0.05). Conclusions Huanshaodan can reduce the mtDNA deletion in aged mice,which suggests that the drugcan reduce the oxida-tive damage of mt DNA and protect mt DNA perfection,provides a experimental evidence for the study of anti-aging mechanism of Chinese medicine in molecular level.

Huanshaodan； senile； myocardial； mtDNA;mice;multi flower knotweed;prepared rhizome of rehmannia;Cistanche salsa

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.006.020.03

2011－03－16

湖南省教育厅资助项目（07C479）。

程莉娟（1979-），女，湖南津市人，讲师，主要从事中药抗衰老的分子机制研究。

* 刘群良，女，教授，E-mail:liuqunliang2000@yahoo.com.cn。