张 翠,贾法玲
(泰山学院生物科学与技术系,山东 泰安 271021)
肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一,在发展中国家的发病率和死亡率呈迅速上升趋势且临床治疗效果不佳[1].现代医学研究发现中药在肿瘤的预防和治疗方面有独特优势,临床常用的治疗肺癌的有效偏方均为多种中药联合使用,每味中药的作用机制尚不明确[2].泰山四叶参(Codonopsis lanceolata Benth.et Hook.F.),根入药,具有清热解毒、止咳祛痰、补虚通乳、健身补气等功效,系泰山四大名药之一[3],其对肺癌的作用及机制国内外尚未见报道.乌拉坦(又称氨基甲酸乙酯,乌来糖)是有机合成和分析常用试剂,能诱发多种小鼠、大鼠产生肺癌[4-10],本文首先对泰山四叶参对乌拉坦诱导的小鼠肺癌的作用及可能的作用机理展开初步研究,旨在为四叶参预防和治疗肺癌提供理论和实验依据.
野生四叶参购自泰安市东方泰山天然药用植物研究所.乌拉坦(Urethan):称取10g溶于100ml生理盐水中,4℃保存备用.环磷酰胺(CTX,江苏恒瑞医药股份有限公司),SOD测试盒(购自南京建成).其他化学试剂均为分析纯.
将干泰山四叶参加入四倍蒸馏水煎煮1h,药渣同法再煎煮两次,过滤,将三次煎煮液混合并浓缩至浓度为180g(生药)/100ml、90g(生药)/100ml、45g(生药)/100ml,4℃保存备用.
六周龄昆明种雌性小鼠,体重约(20±2)g,购自中国人民解放军第88医院.
1.3.1 模型建立与分组
将小鼠随机分为6组,每组10只,分为阴性对照组、预防组、阳性对照组和泰山四叶参多糖低、中、高浓度组.无菌条件下连续腹腔注射0.1ml10%乌拉坦28天,诱导其产生肺癌(随机抽取各组小鼠对肺进行观察,若用肉眼或解剖镜下观察到肺部有略突出表面的圆色灰白色小点,即为肿瘤[7-9]),预防组同时每天给予0.1ml 90%泰山四叶参.之后停止注射乌拉坦,按肿瘤(阴性)对照组(0.1m l生理盐水· d-1)、CTX(阳性)对照组(0.1ml 0.2%CTX·d-1)、低浓度组(0.3ml 45%泰山四叶参·d-1)、中浓度组(0.3ml 90%泰山四叶参·d-1)、高浓度组(0.3ml 180%泰山四叶参·d-1)给药,预防组继续灌胃给予泰山四叶参熬煎剂.
1.3.2 对小鼠生存状态及存活时间的影响
按上述方法连续给药15d,每天记录小鼠体重变化及生存状况,停药后记录每组每只小鼠的生存时间,体重增长率和生命延长率按以下公式计算:
体重增长率(%)=[(小鼠平均终体重—小鼠平终始体重)/小鼠平均始体重]×100
生命延长率(%)=[(药物处理组小鼠平均存活时间—阴性对照组小鼠平均存活时间)/阴性对照组小鼠平均存活时间]×100.
1.3.3 小鼠胸腺、脾、肺、肝脏指数测定及腹腔巨噬细胞吞噬功能实验
按分组连续给药8d,第9天时眼球取血后将小鼠断颈处死,称取胸腺、脾、肺重量,计算其指数.内脏指数计算公式如下:
小鼠连续灌胃给药8d后,连续2天腹腔注射5%蛋白胨溶液0.5ml,两天后,腹腔注射用生理盐水配成的5%(V/V)鸡红细胞悬液,诱导腹腔巨噬细胞吞噬红细胞.1h后处死,解开腹壁皮肤,制作巨噬细胞吞噬涂片[11],晾干后油镜下观察计数.按照下式计算吞噬指数:
吞噬指数=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数÷100个巨噬细胞.
1.3.4 血清、肺、肝脏中SOD活性测定实验
小鼠摘除眼球采血,滴入干燥干净的采血管中,室温静置1~2小时,2000rpm离心10min,取上层得血清.制备肺、肝脏组织匀浆液,按总超氧化物歧化酶(T-SOD)检测试剂盒说明书测定血浆、肝脏、肺的T-SOD活力.
所得数据用统计学软件SPSS12.0进行分析,组间差异显著性采用t检验.
每日称取小鼠体重并观察各组生长状况,停药后记录其生存时间,结果见表1:
表1 泰山四叶参对乌拉坦诱导肺癌小鼠生存时间的影响
实验结束时用药组体重明显高于肿瘤对照组小鼠体重,中浓度用药组体重比低浓度用药组、高浓度用药组增长快,CTX对照组小鼠体重比用药组略低.预防组、高浓度组和CTX对照组延长了乌拉坦诱导肺癌小鼠的存活时间且差异极显著.
测定小鼠胸腺、肺、脾及吞噬指数,结果见表2:
表2 泰山四叶参对乌拉坦诱导肺癌小鼠脏器指数及腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响
由表2可以看出预防组和中高浓度组可明显提高乌拉坦诱导肺癌小鼠的胸腺指数、脾脏指数和吞噬指数,且差异极显著,CTX对照组小鼠的胸腺指数、脾脏指数和吞噬指数明显降低;但各组的肺指数均有所降低.除此之外,实验中观察到正常小鼠肺呈浅红色,颜色鲜艳,而肿瘤对照组肺呈暗红色,表面有灰白色圆点,用药组灰色圆点较少,低、中、高三浓度用药组肺部形态无显著差异.
对各组小鼠血清、肺、肝脏SOD测定,结果见表3:
表3 泰山四叶参对乌拉坦诱导肺癌小鼠血清、肺、肝SOD活性的影响
根据表3所测数据比较各组小鼠血清、肝脏及肺脏中SOD活性,发现预防组、高浓度用药组和CTX对照组显著高于肿瘤对照组,其中高浓度组和CTX对照组血清中SOD活性差异极显著,肝脏和肺脏中差异显著.
肺癌在我国的发病率正迅速上升,并且由于现有的治疗手段疗效较差,导致其死亡率占恶性肿瘤的首位,除了在日常生活中建议大家不要抽烟、拒绝二手烟之外,寻找更加安全、有效的药物仍然是亟需解决的问题.
本实验通过记录各组小鼠体重变化、生长状况和生存时间验证了泰山四叶参对乌拉坦诱导肺癌小鼠有一定预防和治疗作用,其效果是否与泰山四叶参浓度有关尚未有明确证据.通过检测小鼠体内腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性,观察小鼠肺、脾、胸腺形态以及测定小鼠肺、脾、胸腺指数[11]不难发现,泰山四叶参有提高机体免疫力的作用,这与其他研究者的结论基本一致[12].泰山四叶参增强了免疫系统中巨噬细胞的吞噬能力,显著提高了胸腺、脾脏指数,同时降低了肺指数,说明其在增强小鼠免疫力的同时对肺癌有一定的治疗作用,我们认为其抑癌机制可能与此有关.相较于传统化疗药物对实验动物的免疫抑制作用(如CTX),泰山四叶参为代表的中药在新的抗肺癌药物研发中具有较大优势[13].
研究通过测定各组小鼠血清、肺、肝脏SOD活性,可以看出泰山四叶参水煎剂具有较强的抗氧化能力,可以激活小鼠体内SOD活性,通过清除过氧化物损伤达到预防、治疗肺癌的效果.同时通过及时消除体内过氧自由基延缓或消除机体疲劳[14],改善小鼠的生存状态,有利于改善肺癌治疗过程中的毒副作用[15].
本研究说明泰山四叶参对乌拉坦诱发的小鼠肺癌有一定预防、治疗作用,并能提高小鼠的生存质量,延长其生存时间,主要的机制可能与其免疫调节、抗氧化作用有关.但其具体的分子机制仍需做进一步探讨.
泰山四叶参资源丰富,对其进行进一步研究和开发有重要的意义:一方面可积累更多的理论知识,另一方面也可以此为基础利用现代科学技术从传统中药中筛选出新的天然抗肺癌的药物[16],对宣传泰山,使中药走向世界具有重要意义.
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