N-乙酰半胱氨酸对脂多糖刺激仔猪血浆炎性介质的影响

杨震国 侯永清 丁斌鹰 王 蕾 刘玉兰 朱慧玲

N-乙酰半胱氨酸对脂多糖刺激仔猪血浆炎性介质的影响

杨震国 侯永清 丁斌鹰 王 蕾 刘玉兰 朱慧玲

试验研究了乙酰半胱氨酸（NAC）对脂多糖（LPS）多次刺激造成的免疫应激仔猪炎性介质的影响，旨在探讨NAC是否有缓解仔猪免疫应激的作用。选取来源一致、体重相近的18头健康仔猪[杜洛克×长白×大白，体重（11.58±0.26）kg]，随机分成 3个处理（对照组、LPS组和NAC 组），每个处理6个重复，每个重复1头猪。对照组和LPS组饲喂基础日粮，试验组（NAC组）为基础日粮+500 mg/kg NAC，LPS组和NAC组仔猪分别于试验的第10、13、20 d腹膜注射100 μg/kg BW的LPS，对照组注射等量的灭菌生理盐水。试验第10、20 d在注射LPS 3 h后前腔静脉采血，测定血浆TNF-α、COR、IL-6和PGE2含量。试验结果显示：日粮中添加NAC显著缓解了LPS刺激导致的血浆（第10 d）和血浆（第20 d）中TNF-α、COR、IL-6和PGE2含量的升高（P＜0.05）。由此可见，在本试验条件下，LPS刺激引起仔猪血浆中炎性介质升高，日粮中添加500 mg/kg NAC缓解LPS导致的血浆中炎性介质的升高，缓解免疫应激，最终可能缓解LPS刺激引起的生长抑制。

N-乙酰半胱氨酸；脂多糖；仔猪；免疫应激；炎性介质

现代畜牧生产过程中，仔猪在受到病原体或非病原体，如细菌、病毒和内毒素（LPS）等作用时，免疫系统被激活，出现“免疫应激”。免疫应激导致白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（Tunor necrosis，TNF-α）等炎性细胞因子过度释放，IL-1、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子是引起畜禽生长抑制的主要因素[1-2]。因此，通过营养调控手段，添加一些营养物质和调控因子，调节应激仔猪的免疫反应，特别是炎性细胞因子的产生，对缓解仔猪免疫应激导致的生长抑制，应该是一条切实可行的途径。乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）作为小分子物质，易进入细胞，生物利用率高。NAC在体内脱乙酰基生成的半胱氨酸是合成谷胱甘肽（GSH）的前体物质，可以促进GSH的合成，提高组织内GSH含量[3]。研究表明，GSH参与了调节细胞增生、机体免疫应答，也能抑制氧化应激引起的急性和慢性炎症反应（Haddad J J等，2002）[4]。另有研究报道，NAC作为一种巯基供给体，具有抑制炎症反应的作用[3]。前期研究结果表明，日粮中添加500 mg/kg NAC能显著缓解LPS应激导致的仔猪生长抑制（胡尧等，2010）[5]。当前，国内外有关NAC的研究主要集中在抗氧化作用方面，多以小鼠为研究对象，关于乙酰半胱氨酸对脂多糖刺激仔猪免疫应激的影响鲜有报道。本试验通过对断奶仔猪多次注射脂多糖建立免疫应激模型（Johnson等，1994）[6]，研究NAC对仔猪的抗应激作用，为NAC的应用和免疫应激的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

N-乙酰半胱氨酸：市售医药级产品，纯度≥98%；大肠杆菌脂多糖（LPS）：大肠杆菌血清型055:B5（Sigma公司生产）。

1.2 试验动物与试验方法

选用18头（35±2）日龄健康仔猪[杜洛克×长白×大白，体重（11.58±0.26）kg]，按随机原则分成 3 个处理（对照组、LPS组、NAC组），每个处理6个重复，每个重复1头猪。预饲期7 d，正式试验期20 d。正式试验期间对照组和LPS组饲喂基础日粮，NAC组在对照组日粮基础上添加500 mg/kg NAC。于正式试验第10、13、20 d的上午 8:00点，LPS组和 NAC 组分别按100 μg/kg BW在仔猪腹膜下注射大肠杆菌脂多糖，对照组注射相应剂量的灭菌生理盐水。试验第10、20 d在注射LPS 3 h后前腔静脉采血。

1.3 试验日粮与饲养管理

基础日粮参照 NRC（1998）猪的营养需要（8～20 kg）配制，其组成及营养含量见表1。

试验期间猪舍室温维持在22～25℃。仔猪在不锈钢代谢笼中单体饲养，自由采食，乳头式饮水器饮水，定时清扫和消毒猪舍。

表1 基础日粮组成与营养含量（风干基础）

1.4 样品采集

分别于试验第10、20 d注射LPS或生理盐水3 h后前腔静脉无菌采血，用10 ml肝素抗凝管收集，静置15 min后以3 000 r/min离心10 min，取上清液保存至-80℃冰箱中，待测。

1.5 检测指标及方法

采用放射免疫分析法（RIA）测定血浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）和皮质醇（COR）浓度，TNF-α和COR试剂盒购自北京北方生物技术研究所，IL-6和PGE2试剂盒购自北京华英生物技术研究所。

1.6 数据处理

试验数据采用统计软件SPSS 13.0进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和Duncan's法多重比较，以P＜0.05为差异显著性标准。

2 结果与分析（见表2）

由表2可知，LPS首次应激时（第10 d）：与对照组相比，LPS 组 TNF-α、COR、IL-6、PGE2含量显著升高（P＜0.05），NAC组TNF-α和IL-6差异不显著（P＞0.05），COR和PGE2存在显著差异（P＜0.05）；与LPS组相比，NAC组TNF-α、COR、IL-6、PGE2含量显著降低（P＜0.05）。

表2 NAC对脂多糖刺激后仔猪血浆（10、20 d）中炎性介质指标的影响

仔猪经3次LPS刺激后（第20 d）：与对照组相比，LPS组TNF-α、COR、IL-6、PGE2含量显著升高（P＜0.05），NAC 组差异不显著（P＞0.05）；与 LPS组相比，NAC 组TNF-α、COR、IL-6、PGE2含量显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁上的主要成分，易被胃肠道吸收入循环系统。LPS通过刺激单核-巨噬细胞合成和分泌大量的TNF-α、IL-1和IL-6等炎性细胞因子发挥作用，导致仔猪处于免疫应激状态，表现为动物厌食、发烧、生长受阻[6]。相对于其它应激物而言，LPS是模拟免疫应激的理想物质。

目前研究表明，免疫应激期内对机体物质代谢具有特殊意义的细胞因子主要是IL-1、IL-6和TNF-α[7]。TNF-α和IL-6主要由单核-巨噬细胞在动物机体感染和免疫早期合成和分泌的重要的前炎性细胞因子，在免疫应激过程中起着关键的作用，LPS是它们较强的刺激剂之一。TNF-α可以通过某些途径诱导其它炎性介质（如IL-1、IL-6等）的生成，扩大其生物学效应，从不同环节在体内产生炎症反应和组织损伤。IL-6具有多种生物学活性，在急性期反应中刺激肝细胞蛋白质合成，是一种内源性致热原（王蕾，2009）[8]。另外，IL-6与感染和组织损伤有关，其部分生物活性与IL-1相似（Wong等，1988）[9]。因此，IL-6 也可以是感染和组织损伤的预警指标。近年来研究发现，由免疫应答引起的代谢变化是由细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α等）进行调节的[10]。在本试验条件下，首次（第10 d）和第3次（第20 d）LPS刺激均能导致血浆中TNF-α和IL-6含量显著升高，这与Li等[11]结果相似，表明LPS首次和多次刺激后均能使机体免疫反应过度，导致机体损伤。本试验中，与吴虎山等（2005）[12]和靳海英等（2007）[13]研究结果相吻合，日粮中添加500 mg/kg NAC缓解LPS导致的血浆中TNF-α和IL-6水平升高，说明NAC可在一定程度上缓解LPS刺激导致的仔猪炎症反应。其可能作用机理如下：

外源性还原型谷胱甘肽或其前体N-乙酰半胱氨酸均可通过提高细胞中谷胱甘肽水平，抑制IκB磷酸化，从而抑制核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）活化[14]。NF-κB含有多种细胞因子基因启动子（如TNF-α、IL-1和IL-6等）部位的κB结合位点，调节细胞基因转录的关键因子。NF-κB活性被抑制后，其调控转录的炎性细胞因子TNF-α和IL-6产生、释放也相应的减少，最终趋向平衡，免疫应激得到缓解[15]。

COR是负反馈调节免疫反应的重要成分，也是应激反应的重要标志之一，可防止免疫反应过度造成对机体的损害。当机体发生应激时，皮质醇水平相应升高，促进蛋白质和脂肪分解以动员能量，增加动物对应激的适应能力[16]。本试验结果发现，首次（第10 d）和第3次（第20 d）注射LPS后，和刘玉兰等[17]的研究结果一致，LPS组血浆中COR的含量均显著增加（P＜0.05），表明LPS首次和多次刺激后均能导致机体免疫应激。而日粮中添加500 mg/kg NAC降低血浆和小肠粘膜中COR水平（P＜0.05），说明NAC可缓解LPS刺激导致的机体免疫应激。

PGE2是一种重要的调节免疫反应的炎性介质，是机体损伤后免疫功能抑制与分解代谢亢进的重要始动因素之一，其过度产生、释放与感染过程中细菌、内毒素对单核巨噬细胞的作用有关[18,8]，在免疫应激过程中充当信使角色（刘玉兰，2004）[17]。本试验结果发现，首次应激后（第10 d），LPS组血浆中PGE2的含量显著增加（P＜0.05），这和刘玉兰[19]的研究结果一致；第三次注射LPS后（第20 d），血浆中PGE2的含量均显著增加（P＜0.05），表明LPS首次和多次刺激后导致机体炎性介质增多。Rietschel等[20]研究报道，LPS作为一种强烈的刺激因子，其作用强度与单核巨噬细胞产生PGE2效应成正相关。本试验中，日粮中添加500 mg/kg NAC显著降低血浆中PGE2水平（P＜0.05），说明NAC可缓解LPS刺激导致的仔猪机体炎性介质的增多，进而缓解营养物质从维持生长向缓解免疫应激的转移。

4 结论

在本试验条件下，LPS刺激引起免疫应激，日粮中添加500 mg/kg NAC可缓解LPS导致的血浆中炎性因子的升高，缓解免疫应激，进而缓解LPS刺激引起的生长抑制。

[1] Van Deuren M,Dofferhoff A S M,van Der Meer J W M.Cytokiness and the response to infection[J].1992,168:349-356.

[2] 刘坚,侯永清,丁斌鹰,等.α-酮戊二酸对脂多糖应激断奶仔猪生长抑制的缓解作用[J].动物营养学报,2009,21（4）:519-524.

[3] 乔玲,李亚明,段钟平.N-乙酰半胱氨酸的作用机制及在肝病中的应用[J].医学综述,2007,13（1）:39-41.

[4] Haddad J J,Land S C.Redox signaling-mediated regulation of lipopolysaccharide-induced proinflammatory cytokine biosynthesis in alveolar epithelial cells [J].Antioxid Redox Signal,2002,4（1）:179-193.

[5] 胡尧,张丽丽,侯永清,等.N-乙酰半胱氨酸对脂多糖应激仔猪生长性能及血浆生化指标的影响[J].动物营养学报,2010,22（4）:1007-1011.

[6] Johnson R W,E von Borell.Lipoplysaccharide-induced sickness behavior in pigs is inhibited by pretreament with indomethacin[J]..J.Anim.Sci.,1994,72:309-314.

[7]张乃峰.蛋白质与氨基酸营养对早期断奶犊牛免疫相关指标的影响[D].北京:中国农业科学院,2008.

[8] 王蕾.α-酮戊二酸对脂多糖刺激仔猪肌肉和肠黏膜组织生长与代谢的影响及其分子机理影响[D].武汉:武汉工业学院,2009.

[9] Wong G G,Clark S C.Multiple actions interleulin-6 within a cytokine network[J].Immunol Today,1988,137:9-14.

[10] Webel D M,Finck B N,Baker D H,et al.Time course of increased plasma cytokines,cortisol,and urea nitrogen in pigs following intraperitoneal injection of lipopolysaccharide[J].J Anim Sci.,1997,75:1514-1520.

[11] Li J,Li D F,Xing J J,et al.Effects of β-glucan extracted from saccharomyces cerevisiae on growth performance,and immunological and somatotropic responses of pigs challenged with Escherichia coli lipopolysaccharide[J].Journal of Animal Science,2006,84:2374-2381.

[12] 吴虎山,李灵敏,苗宇船.N-乙酰半胱氨酸对脂多糖所致枯否细胞功能改变的影响[J].山西中医学院学报,2005,6（1）:49-51.

[13] 靳海英,任锋,丁美,等.N-乙酰半胱氨酸对猪急性肝衰竭血清肿瘤坏死因子-α、白介素-1β 的影响[J].药品评价,2007,4（3）:153-156.

[14] Bdldwin A S Jr.Series introduction:the transcription factor N F-kappaB and human disease[J].J Clin Invest,2001,107（1）:3-6.

[15] Rahman I.Regulation of nuclear factor-kappaB,activator protein-1,and glutathione levels by tumor necrosis factor-alpha and dexamethasone in alveolar epithelial cells[J].Biochem Pharmacol,2000,60（8）:1041-1049.

[16] 程忠刚，林映才，周桂莲，等，大豆黄酮对断奶仔猪生产性能、血清免疫指标和激素水平的影响 [M].第四届全国猪营养学术研讨会论文集,2008:348-352.

[17] 刘玉兰,李德发,龚利敏,等.免疫应激对断奶仔猪免疫和神经内分泌激素的影响[J].中国畜牧杂志,2004,4（40）:4-6.

[18] Stephan R N,Conrad P J,Saizawa M,et al.Prostaglandin E2depressesantigen-presentingcellfunctionofperitonealmacrophages[J].The Journal of Surgical Research,1988,44（6）:733-739.

[19] 刘玉兰.鱼油对断奶仔猪抗免疫应激机理研究[D].北京:中国农业大学,2003.

[20] Rietschel E T,Schade U,Jensen M,et al.Bacterial endotoxins:chemical structure biological activity and role in septicaemia[J].Scand J Infect Dis,1982,31:8.

S816.32

A

1001-991X（2011）09-0030-03

杨震国，武汉工业学院动物营养与工程学院，饲料科学湖北省重点实验室，430023，湖北省武汉市汉口常青花园学府南路68号。

侯永清（通讯作者）、丁斌鹰、王蕾、刘玉兰、朱慧玲，单位及通讯地址同第一作者。

2010-11-15

武汉市学术带头人计划项目[200951830554]，湖北省自然科学基金计划创新群体项目[2007ABC009]，湖北省高等学校优秀中青年团队计划项目[T200810]

（编辑：王 芳，xfang2005@163.com）